特点:
● 一个样品同时检测两种指标
● 包含所有所需试剂
● 详细的操作步骤
规格性状
产品概述
线粒体功能与细胞代谢之间的联系是众所周知的,对一系列疾病都有影响,包括癌症、衰老和神经退行性疾病。已经发现,衰老细胞通常依靠糖酵解系统生存,而不是利用线粒体能量来源。相反,即使糖酵解系统受到抑制,通常严重依赖糖酵解的癌细胞激活线粒体功能依然能确保其存活,。鉴于这些观察结果,越来越有必要研究线粒体功能和糖酵解途径,以增强我们对细胞内代谢改变的理解。我们的试剂盒允许测量乳酸产生(通过乳酸测定)以检测糖酵解系统的变化,以及线粒体膜电位(通过JC-1测定)以评估线粒体功能。该试剂盒的概念是提供来自同一样品的全面一站式检测,以跟踪细胞内代谢的变化并指导后续更详细的分析。该试剂盒包括检测所需的所有试剂,还提供组合方案。
产品特点
任何刺激引起的细胞内代谢变化都可以通过测量乳酸产生和线粒体膜电位来检测。
在某些情况下,尽管细胞糖酵解系统或线粒体功能(能量产生的主要途径)受到损害,但细胞仍设法存活。据了解,这是因为细胞努力通过增强糖酵解来持续并防止细胞死亡,即使线粒体功能受损,或者在糖酵解受损时激活线粒体功能,同时监测糖酵解系统和线粒体功能。如下所述,可以深入了解细胞内发生的事情。
同时测量同一样品
通过从单个样品中分离上清液和细胞,可以同时测量线粒体膜电位(JC-1测定)和乳酸产生。详细的测量方法在说明书中描述。
检测原理
该试剂盒包括乳酸检测试剂盒,旨在通过测量WST甲臜吸光度来检测细胞培养基中的乳酸产生。此外,它还具有JC-1染料,用于使用荧光测量检测细胞内的线粒体膜电位。使用酶标仪在同一样品上轻松定量这两个靶标,便于评估代谢变化。
实验例
用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)处理的HeLa细胞的细胞内代谢变化
当我们使用CCK-8*测定法评估8-DG处理的HeLa细胞的细胞活力时,我们观察到活力的微小变化。然而,鉴于观察到乳酸产生的减少,它促使我们质疑尽管糖酵解系统受到抑制,如何维持细胞活力。为了回答这个问题,我们使用JC-1测定法检查了线粒体膜电位。这项研究的结果表明,当糖酵解系统被2-DG抑制时,HeLa细胞通过增强线粒体功能来维持其存活。
※ 细胞计数试剂盒-8(产品代码:CK04)不包含在本试剂盒中。
常见问题Q&A
Q:每个试剂盒可以检测多少样品? | |
A:【乳酸测定】按每个样品3个复孔计算,您可以检测到如下样品数量
*如果样品的乳酸浓度未知,请进行预实验,以确定稀释比例,使其低于1 mmol/l乳酸标准溶液的吸光度。 请参照说明书中“检测样品的制备”。 *进行预实验或不进行预实验时,可检测的最大样品数详见以上表格。 *进行乳酸测定时,如培养基含有血清,建议制备一个含血清的培养基的测量样品,作为背景对照。 乳酸测定的孔板设置示例(n = 3) (左:无预实验,右:预实验) 【JC-1 检测】 ※ 本试剂盒,至少可使用96孔板检测48个孔。 |
Q: 使用此试剂盒进行乳酸检测和 JC-1 检测需要多长时间? |
A: 实验流程和每次测定所需的时间(大约)如下图所示。 |
Q: 【乳酸检测】是否可以先进行乳酸测定,然后在收集上清液后进行JC-1测定? |
A: 如果首先进行乳酸测定,测量时间的差异可能会由于刺激条件的不同而影响结果。 收集上清液后,请务必先进行JC-1测定。 细胞培养上清液可冷冻(-20°C)保存1个月。 |
Q: 【乳酸检测】乳酸测定可以使用450 nm以外的波长进行测量吗? |
A: 除了 450 nm 外,它还可与 490 nm 滤光片一起使用。 但是,吸光度值会低于在450nm处测量时的值。 |
Q: 【乳酸检测】乳酸测定可以测量含有还原性物质的样品吗? |
A:如果样品中含有还原性物质,染料WST会变色,您可能无法准确测量乳酸的变化。 如果您的检测物质中含有还原性物质,请准备一些只有待测物+培养基的孔【不含细胞】,作为背景对照。最后计算时,从标准曲线/样品吸光度结果中扣除以上背景对照。 |
Q:【乳酸检测】工作液稳定性如何? |
A:工作液无法保存。 请现配现用。 另外,由于它对光不稳定,因此避光,工作液在室温避光条件下,可稳定保存4个小时。
一旦工作液未避光,则颜色会从红色变为橙色,从而导致背景的增加。 |
Q:【乳酸检测】细胞培养上清液样品可以保存吗? |
A:可以冷冻(-20°C)储存1个月。 |
Q:【JC-1 检测】我可以使用含血清的培养基吗? |
A:含血清的培养基可以在清洗细胞或制备JC-1工作液时使用,在荧光观察时,我们建议使用Imaging Buffer溶液,但如果一定要使用含血清的培养基,也建议使用无酚红的培养基。 |
Q:【JC-1检测】是否可以固定细胞? |
A:不建议,由于线粒体固定后会发生去极化,因此染色后固定和固定后染色都是不可能的。 |
Q:【乳酸检测】检测到的样品的吸光度与空白孔的吸光度相同, 原因和解决方案是什么? |
A:原因可能是细胞释放的乳酸量低。 首先,请增加要接种的细胞数量或进一步延长孵育时间。 |
Q:【JC-1检测】如何解释增加(或减少)红色和绿色的荧光值的结果? |
A:计算每个药物处理后的样品和对照组的红色与绿色荧光值的比率。将两者进行比较,荧光比越低,线粒体膜电位越低。
【按红/绿比评估的原因】 由于JC-1以膜电位依赖性方式在细胞中积累,因此每个细胞的JC-1浓度可能因细胞的状态而变化1),2)(由于细胞条件的不同,实验组和对照组的JC-1累积浓度不同)。 此外,当线粒体膜电位高时,JC-1聚集,其荧光从绿色变为红色。 JC-1累积的量则取决于膜电位3)因此样品的线粒体膜电位变化可以通过红/绿比进行分析比较。 〈参考资料〉 1) A. Cossarizza, et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40. 2) A. Perelman, et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430. 3) S. T. Smiley, et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671. |