Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。

脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢¹⁾，自噬²⁾和细胞衰老³⁾等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测

检测条件：

* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm

* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm

* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm

* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm

染色条件：

在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red：1 μmol/l) 染色15 min后观察。

如何制备油酸溶液

请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。

Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。

*1. 与绿色荧光共染时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。

*2. 关于共染时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。

*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。

特点1：与抗体检测方法高度相似

4％PFA固定HepG2细胞后，用100 nmol/l Lipi-Blue染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色， 该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。 实验证明Lipi-Blue与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。

<检测条件> 

Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，

抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex：640 nm / Em：650-700 nm

特点2：高特异性定位脂滴

在HeLa活细胞中加入油酸，并用100 nmol/l Lipi-Blue和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。

<检测条件> 

Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，

Nile Red：Ex：561 nm / Em：565-650 nm

特点3：荧光在细胞中滞留时间长

分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h时的荧光图像。

实验证实Lipi-Blue和Lipi-Green在培养24 h后虽然荧光强度有所降低，但仍有荧光。 而Lipi-Red，Lipi-Deep Red，Nile Red和市售试剂B在培养24 h后几乎无荧光，不适合长时间的实时成像观察。

实验例1：脂肪细胞的脂滴成像

用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。

<脂肪细胞染色实验例>

(1)将3T3-L1细胞(1.5×10⁴cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO₂培养箱内培养。

(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。

(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。

(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。

(5)用荧光显微镜观察。

※试剂浓度：各2.5 µmol/l

实验例2：脂肪组织的脂滴成像

用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。

<组织样品的染色实验例>

(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。

(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。

(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。

※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)

实验例3：使用细胞成像仪进行定量分析

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HepG2细胞中，并比较脂滴的变化。在分析中，我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。

脂肪滴和细胞核的成像

使用共聚焦定量细胞成像仪在447/60 nm处拍摄脂滴图像，在525/50 nm处拍摄细胞核图像，在分析软件CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核，并计算其数量和面积。

横河电机CQ1拍摄条件

使用板：96 well plate，物镜：20倍

激发波长 ：405 nm (Lipi-Blue)：蓝色、488 nm (SYBR Green)： 绿色

黄框线：细胞核、红框线：脂滴

脂滴数量及面积的分析

根据细胞核和脂滴的检测数据，每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果，加入油酸的脂滴增加了7-10倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴数量减少到Control组的50-60%。

细胞处理及脂滴染色条件

将HepG2细胞(1×10³cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后，加入未处理（仅含FBS的DMEM培养基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基）或Triacsin C（含5 µmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基）过夜培养。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室温下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入0.5 μmol/l Lipi-Blue working solution在室温、避光下染色2 h后，用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。

1) Y. Tatenaka, H. Kato, M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, H. Nishitoh and Y. Ueno, “Monitoring Lipid Droplet Dynamics in Living Cells by Using Fluorescent Probes”, Biochemistry., 2019, DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01071 .

1) Y. Tatenaka, H. Kato, M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, H. Nishitoh and Y. Ueno, “Monitoring Lipid Droplet Dynamics in Living Cells by Using Fluorescent Probes”, Biochemistry., 2019, DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01071 .