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NO.1. Biotin Labeling Kit – NH2 生物素标记-氨基
NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.3. Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit 细胞活性/毒性双重检测
NO.4. Fluorescein Labeling Kit – NH2 FITC（488激发）标记-氨基
NO.5. Biotin Labeling Kit – SH 生物素标记-巯基
特点：
● 享有显色底物WST专利
● 用于L-Glutamate的定量
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凑单关联产品TOP5
NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.2. Glutamine Assay Kit-WST 谷氨酰胺的定量检测
NO.3. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽定量
NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测
NO.5. Mito-FerroGreen 铁离子荧光探针
试剂盒内含
产品概述
谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。
Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。
原理
本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。
操作步骤
只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。
实验例
标准曲线的实验例：
样品中的谷氨酸浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酸标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酸浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。
谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：
将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。
结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。
铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:
据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。
Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：
将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。
结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。
<使用产品>
· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）
· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）
· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）
· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）
<实验条件>
细胞：A549细胞 (1 x 106 cells) 药物处理时间：48 h
参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.
常见问题Q&A
| Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量是多少？ |
| A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。
100 tests 样品数量(n=3) 24个样品(参照下图) 谷氨酸标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)
|
| Q2：配制后的Working solution可以保存多久？ |
| A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。
※Working solution配制后，避光室温条件下4 h稳定。当暴露于光线下，溶液的颜色会变成褐色。 |
| Q3：是否可以定量D-Glutamate？ |
| A3：该试剂盒是用于L-Glutamate定量，无法定量D-Glutamate。 |
| Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？ |
| A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酸浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。 |
| Q5：待测样品可以保存吗？ |
| A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。
细胞裂解样品也可以-20°C保存1个月。 但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。 |
| Q6：为什么我的样品孔没有显色？ |
| A6：样品中的谷氨酸浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酸浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。
如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酸浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酸浓度调整到最低检测限以上。 |
| Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？ |
| A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)
|
参考文献
1)Cobler,L.et al.,”xCT inhibition sensitizes tumors to γ-radiation via glutathione reduction”,Oncotarget,2018,9,32280-32297.
2)Tobias,M.et al.,”Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication”,Free Radical Bioglogy and Medicine,2019,133,144-152.
3)K. Danchana, H. Iwasaki, K. Ochiai, H. Namba, T. Kaneta, “Determination of glutamate using paper-based microfluidic devices with colorimetric detection for food samples”, Microchem. J., 2022, doi:10.1016/j.microc.2022.107513.
4)Z. Xie, T. Kawasaki, H. Zhou, D. Okuzaki, N. Okada and M. Tachbana, “Targeting GGT1 Eliminates the Tumor-Promoting Effect and Enhanced Immunosuppressive Function of Myeloid-Derived Suppressor Cells Caused by G-CSF”, Front. Pharmacol., 2022, doi:10.3389/fphar.2022.873792.
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氧化应激与自由基
品名货号用途
| Glutamine Assay Kit-WST试剂盒 | G268 | 谷氨酰胺的定量检测 |
| Glutamate Assay Kit-WST试剂盒 | G269 | 谷氨酸的定量检测 |
细胞中的氧化应激是由代谢、电离辐射和与DNA直接相互作用的致癌化合物产生的ROS导致的。在代谢的过程中，小部分的氧由于一个电子的还原变成超氧阴离子，接着超氧阴离子被超氧化物岐化酶 (SOD) 转变成氧气和过氧化氢。过氧化氢由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶还原成水。然而如果过氧化氢并没有被这些酶完全还原，当它被铁(Fenton反应)氧化将产生反应性极强的羟自由基。羟自由基还可以由紫外线照射产生或直接电离辐射水产生。羟自由基可以与脂反应产生脂质过氧化物。然而并非所有ROS都是有害的。次氯酸盐离子是一种由中性粒细胞的髓过氧化物酶产生的过氧化氢衍生而来的ROS，它具有杀菌活性。NO也称为内皮来源的舒张因子，它是由NO合成酶产生的。不过NO和超氧阴离子反应可产生具有细胞毒性的过氧亚硝基阴离子。ROS和活性氮化合物在生物系统中具有许多不同的活性。相应地好氧生物会产生防止氧化应激的防御机制。最近在对防御机制以及氧化损伤与疾病或老化过程之间关系的研究中，氧化应激已成为许多研究的焦点。最终已发展出许多用于检测ROS相关或ROS来源的物质的方法，这些物质包括超氧阴离子、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、DNA损伤、8-氧基鸟嘌呤、8-硝基鸟嘌呤和蛋白质羰基等。
品名货号用途
| Biotin Labeling Kit – NH2试剂盒 | LK03 | 生物素标记-氨基（50-200ug/sample） |
| Biotin Labeling Kit – NH2 (for 1mg)试剂盒 | LK55 | 生物素标记-氨基（1 mg/sample） |
| Biotin Labeling Kit – SH试剂盒 | LK10 | 生物素标记-巯基（50-200ug/sample） |
| Ab-10 Rapid Biotin Labeling Kit试剂盒 | LK37 | 生物素标记-氨基（10 ug/sample） |
| Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂 | BK01 | 生物素标记-氨基（1-5 mg/sample） |
| Biotin-PE-maleimide试剂 | B592 | 生物素 |
| Biotin-SS-Sulfo-Osu试剂 | B572 | 生物素 |
| Biotin-AC5-Osu试剂 | B305 | 生物素 |
| Biotin-(AC5)2-Osu试剂 | B306 | 生物素 |
| Biotin-Osu试剂 | B304 | 生物素 |
| Biotin-PEAC5-maleimide试剂 | B299 | 生物素 |
| ARP(Aldehyde Reactive Probe)试剂 | A305 | 生物素 |
特点：
● pH敏感型荧光标记染料
● 试剂盒包括所有试剂
● 详细的标记手册
产品概述
本款试剂盒一套试剂盒就包含了全部所需材料，可以对目标物质的内吞作用进行可视化分析。
试剂盒中包含的NH2-反应性AcidSensor（荧光探针）具有分子内活性酯基，与含氨基的目标物质（蛋白质）混合后形成稳定的共价键。AcidSensor标记后可在633纳米处被激发，可满足同时与绿色或红色荧光进行多重染色。
AcidSensor标记后在中性条件下几乎没有荧光，而在细胞中受环境酸化影响后会发出荧光，并被内吞作用所吸收。
*注意：
・与内吞作用的检测染料ECGreen（产品代码：E296）不同，本试剂盒是对进入细胞的目标物质进行染色。
本试剂盒可以标记分子量超过50,000和含有活性氨基的样本。
・本试剂盒也会标记分子量在10,000以上的除标记样本以外的含氨基的共存物质，这些物质也会被标记和回收。请在使用前对样品溶液进行纯化。
原理
AcidSensor的反应原理与细胞内吞途径的示意图
与其他产品的比较
实验例1
THP-1 细胞对标记凋亡细胞的吞噬作用实验
AcidSensor 标记的物质会被细胞吸收，当它们到达溶酶体等酸性细胞器时，荧光会增强。利用这一特性，我们通过将 AcidSensor 标记的凋亡细胞与 Calcein 标记的 THP-1 巨噬细胞共培养来评估凋亡细胞的吞噬活性。 结果，通过流式细胞术观察到了钙蓝蛋白（绿色）/AcidSensor（深红色）双阳性细胞，表明 THP-1 巨噬细胞吞噬了凋亡细胞（图 1a）。此外，当细胞松弛素 D 抑制 THP-1 巨噬细胞的吞噬作用时，双阳性细胞的比例也会下降（图 1b 和 1c），这证实该检测系统能准确评估吞噬作用。
最近的一份报告显示，抑制线粒体功能会诱导培养的小胶质细胞（中枢神经系统中的常驻巨噬细胞）转向糖酵解并减少吞噬作用*。为了复制这一结果，我们使用线粒体抑制的 THP-1 巨噬细胞进行了吞噬试验。结果显示，短链氯化石蜡是线粒体氧化磷酸化的强效解偶联剂，它能降低 THP-1 巨噬细胞的线粒体膜电位（MT-1，红色）（图 2）并减少吞噬作用（图 3）。
使用产品：
①AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 【货号: A558】
② -Cellstain- Calcein-AM 【货号：C542】
③ MT-1 MitoMP Detection Kit 【货号：MT13】
实验步骤：
制备 AcidSensor 标记的凋亡细胞（检测前一天）
1. 向 NH2-Reactive AcidSensor 中加入 10 μl DMSO 并溶解。将 5 μl NH2-Reactive AcidSensor 溶液加入 5 ml HBSS，制成工作液（稀释 1000 倍）。
2. 用 HBSS 冲洗 Jurkat 细胞两次。
3. 将 Jurkat 细胞（5×107 个）转移到试管中，离心后去除上清液。
4. 将工作液加入到装有 Jurkat 细胞（5×107 个）的试管中并悬浮。
5. 5. 37°C 孵育 30 分钟，用 AcidSensor 进行标记。
6. 标记后，用 HBSS 冲洗细胞两次。
7. 将标记了 AcidSensor 的 Jurkat 细胞悬浮在含有 10%FBS、添加了 0.5 μM 石杉碱的 RPMI 培养基中。
8. 在培养箱（37°C，5% CO2）中隔夜培养 18 小时，诱导细胞凋亡。
使用 THP-1 巨噬细胞进行吞噬试验
1. 为了将 THP-1 细胞分化成巨噬细胞，将 THP-1 细胞以 1×106 个细胞/孔的数量播种到 6 孔板中，然后在培养箱中用 100 nM PMA 培养 3 天。
2. 2. 用 HBSS 冲洗 THP-1 巨噬细胞两次后，在孔中加入含 HBSS 溶液的 Calcein-AM（货号：C542，0.5 μg/ml）和 MT-1（货号：MT13，1000 倍稀释），在培养箱中培养 30 分钟。
3. 用培养液清洗两次。
4. 用 10 μM Cytochalasin D培养 1 小时，或用 5 μM FCCP 培养 30 分钟。
5. 用培养液清洗两次后，将 AcidSensor 标记的凋亡细胞（3×106 个细胞/孔）加入到含有或不含细胞松驰素 D 或 FCCP 的孔中。细胞在培养箱中培养 4 小时。
6. 用 HBSS 冲洗两次。
7. 加入 500 μl Imaging 缓冲溶液（货号：MT13），用细胞刮板收集平板上的 THP-1 巨噬细胞。
8. 用流式细胞仪分析细胞悬浮液。
实验例2
使用AcidSensor标记的BSA和小鼠IgG被HeLa细胞吸收的情况
使用该试剂盒将标记的BSA或小鼠IgG加入HeLa细胞中，2小时后观察HeLa细胞的吸收情况。
结果，在HeLa细胞中检测到了AcidSensor的荧光，证实两种标记的物体都被内吞途径吸收了。
＜检测条件＞
仪器:共聚焦显微镜
Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm
实验例3
与内体染料共染
标记的IgG的细胞摄取量随时间变化
用本试剂盒的AcidSensor标记的小鼠IgG和Dojindo的内吞检测染料（货号E296, ECGreen -Endocytosis Detection）一同添加到HeLa细胞中。
染色后10分钟、20分钟和180分钟观察细胞，结果显示AcidSensor（深红色）和内体膜（绿色）在同一位置定位，表明小鼠IgG是通过内吞作用途径被细胞吸收的。
＜检测条件＞
绿：ECGreen
(Ex = 405 nm, Em= 500-550 nm)
紫：AcidSensor
(Ex = 633 nm, Em= 650-700 nm)
常见问题Q&A
| Q1: 样品溶液中存在的物质是否会影响标记反应？ |
| A1:
取决于存在的物质种类。 在确认溶液中含有哪些物质后，对样品进行相应的纯化。 样品中共存的带有氨基的化合物和分子量超过10,000的化合物会降低标记效率，并且由于其分子量高，不能被过滤管去除。即使是没有氨基的化合物，高分子量的杂质也会造成过滤器的堵塞，从而影响标记和纯化。请在使用前对样品进行纯化。
|
| Q2:回收标记体所使用的WS buffer是否有细胞毒性？ |
| A2: WS buffer中含有几乎不会对细胞产生毒性的稳定剂（表面活性剂）。如果无论如何还是介意表面活性剂，可以根据自身习惯来选择合适的缓冲液来回收标记体。 |
| Q3:如果用含有血清的培养基回收标记体，是否会影响观察？ |
| A3: 血清中的成分虽然不会对AcidSensor的性能产生影响，但是由于血清中的蛋白质也会通过内吞途径进入细胞，可能会与标记的蛋白质的摄取产生竞争。请您根据自身实验目的进行判断。 |
| Q4:如何计算标记率？ |
| A4: A用WS buffer 5倍稀释标记体，然后检测500 nm和280 nm处的吸光度，按照下列公式进行计算，得出标记率。
A500： 500 nm 的吸光度 A280： 280 nm 的吸光度 εprotein： 蛋白质的280 nm处的摩尔吸光系数 NH2-Reactive AcidSensor 在WS buffer中的 A500 的摩尔吸光系数为[48400]。 NH2-Reactive AcidSensor 在280nm和500nm的吸光度、280nm/500nm的比值为[0.16]。 |
| Q5:每个蛋白质分子上会有多少个AcidSensors标记上？ |
| A5:对于小鼠IgG，我们已经确认每个分子平均有三个AcidSensors被标记。 |
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特点：
● 无需另外准备试剂
● 操作简便
● 3色可选
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