C14H16N2O6
308.29
C14H16N2O6
308.29
C14H16N2O8S2
404.42
C16H18N2Na2O14S2
572.43
C14H14N2Na2O14S4
608.51
C18H22N3NaO8S3
527.57
关联产品
实验工具稀释计算器摩尔浓度计算器
特点:
● 标记的物质可以在大约2个小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 标记的物质可以用所附的保存溶液保存。
试剂盒内含
产品概述
ICG(吲哚菁绿)是一种花青颜料,也用于肝功能和肝储备测试的色素负载测试中,并且在近红外区域具有荧光。激发波长在774nm附近,荧光波长在805nm附近,并且具有即使在体内使用也不容易被血红蛋白干扰的荧光特性。因此,期望将其应用于使用近红外荧光的体内荧光成像。 ICG标记试剂盒-NH2是用于标记具有氨基基团的蛋白质(尤其是抗体)的试剂盒。套件随附的NH2-Reactive以及已发布的荧光素标记套件–NH2(代码:LK01),HiLyte FluorTM 555标记套件–NH2(代码:LK14),HiLite FluorTM 647标记套件–NH2(代码:LK15)由于ICG在分子中具有活性酯,因此仅通过与具有氨基的分子混合即可形成稳定的共价键。当将ICG标记在蛋白质上时,可以使用随附的过滤管轻松去除抑制标记反应和未反应的NH2反应性ICG的低分子量化合物(例如Tris)。对于ICG标记的IgG,荧光波长为774/805nm。
该试剂盒包含标记所需的试剂和用于储存准备好的ICG标记产品的溶液。
原理
操作步骤
使用注意事项:
如果样品中含有分子量>10,000的物质 (多肽、其它蛋白等),有阻碍标记反应的可能性。在标记前需要先纯化,如果样品是抗体,可用 IgG Purification Kit (AP01,AP02)纯化,如果样品中有小的不溶物质,离心后取上清液来标记。
操作步骤:
a) 蛋白溶液量要≤100ul,如果抗体浓度<0.5mg/ml,重复步骤1和2直至总蛋白量达到50-200ug。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上,继续离心5min或提高转速。
c) NH2-Reactive ICG在管子的底部,加10ul DMSO到管子的底部,用移液器反复吹打溶解。由于NH2-Reactive ICG会被DMSO中的水分水解,在制备好NH2-Reactive ICG溶液后马上进行第4步操作。
d) 如果蛋白总量达到200ug,请加入全部NH2-Reactive ICG溶液。
e) 我们推荐用WS Buffer保存标记产物,但也可以根据下一步实验要求选择合适的缓冲液。
产品优势
1)标记的物质可以在大约2个小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50至200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)标记的物质可以用所附的保存溶液保存。
ICG标记实验例
图. 小鼠尾静脉注射ICG抗体的荧光成像图小鼠皮下肿瘤模型在注射了ICG抗体 (50ug) 48h后,有明显的迹象表明抗体在肿瘤中有选择性地聚集。
仪器:活体成像仪 (Clairvivo OPT,岛津制作所)
小鼠:BALB/c(nu/nu) 纯合子裸小鼠 (母,11周)
肿瘤细胞:HeLa细胞 (在右腋皮下移植后4周)
检测条件:Ex=785nm,Em=845/55nm
抗体:整合素α2抗体 曝光时间:10s
荧光特性
常见问题Q&A
Q1: 标记小分子蛋白质(分子量50,000或以下)的方法。 |
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器,因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质,并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时,可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质,如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长,因此请注意离心时间。 |
参考文献
1) M. Ogawa, C. A. S. Regino, J. Seidel, M. V. Green, W. Xi, M. Williams, N. Kosaka, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “Dual-Modality Molecular Imaging Using Antibodies Labeled with Activatable Fluorescence and a Radionuclide for Specific and Quantitative Targeted Cancer Detection”, Bioconjugate Chem., 2009, 20(11), 2177. |
2) M. Ogawa, N. Kosaka, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “In vivo Molecular Imaging of Cancer with a Quenching Near-Infrared Fluorescent Probe Using Conjuates of Monoclonal Antibodies and Indocyanine Green”, Cancer Res., 2009, 69(4), 1268. |
3) N. Kosaka, M. Ogawa, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “Clinical implications of near-infrared fluorescence imaging in cancer”, Future Oncology, 2009, 5(9), 1501. |
4) 伊藤進, 六車直樹, 林重仁, 日下至弘, 多田津昌也, 多田津陽子, 岡本耕一, 井本佳孝, 稲山久美, 坂東輝美, 田岡聡子, 高川真由子, 矢野充保, 伊井邦雄, 長尾善光, 佐野茂樹, 芝村誠一, 島田典昭, 石田和彦, 中村一成, “赤外線蛍光内視鏡の原理と臨床応用”, Biomedical THERMOLOGY, 2003, 23(2), 77. |
5) S. Ito, N.Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, T. Bando, K. Inayama, M. Sogabe, T. Okahisa, S. Okamura, H. Shibata, T. Irimura, K. Takesako and S. Shibamura, “Development of Agents for Reinforcement of Fluorescence on Near-infrared Ray Excitation for Immunohistological Staining”, Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 613. |
6) S. Ito, N. Muguruma, Y. Kakehashi, S. Hayashi, S. Okamura, H. Shibata, T. Okahisa, M. Kanamori, S. Shibamura, K. Takesako, M. Nozawa, K. Ishida and M. Shiga, “Development of Fluorescence-Emitting Antibody Labeling Substance by Near-Infrared Ray Excitation”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 2689. |
7) K. Inayama, S. Ito, N. Muguruma, Y. Kusaka, T. Bando, Y. Tadatsu, M. Tadatsu, K. Ii, S. Shibamura and K. Takesako, “Basic Study of an Agent for Reinforcement of Near-infrared Fluorescence on Tumor Tissue”, Digestive and Liver Disease, 2003, 35, 88. |
8) S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, T. Bando, Y. Kusaka, M. Yano, S. Ichikawa, A. Hiasa, T. Omoya, H. Honda, I. Shimizu, K. Ii, K. Nakamura, K. Takesako, Y. Goto and S. Shibamura, “Visualization of Human Gastric Cancer with a Novel Infrared Fluorescent Labeling Marker of Anti-carcinoembryonic Antigen Antibody in vitro”, Dig. Endosc., 2000, 12, 33. |
9) S. Taoka, S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, Y. Kusaka, K. Ii, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako and S. Shibamura, “Reflected Illumination-type Imaging System for the Development of Infrared Fluorescence Endoscopy”, Dig. Endosc.,1999, 11(4), 321. |
10) S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, A. Tsutsui, T. Fukuda, T. Okahisa, Y. Ohkita, H. Matsunaga, I. Shimizu, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako and S. Shibamura,”Development of an Imaging System Using Fluorescent Labeling Substances Excited by Infrared Rays”, Dig. Endosc., 1997, 9, 278. |
11) S. Ito, N. Muguruma, Y. Kusaka, M. Tadatsu, K. Inayama, Y. Musashi, M. Yano, T. Bando, H. Honda, I. Shimizu, K. Ii, K. Takesako, H. Takeuchi and S. Shibamura, “Detection of Human Ganstric Cancer of Resected Specimens Using a Novel Infrared Fluorescent Anti-Human Carcinoembryonic Antigen Antibody with an Infrared Fluorescence Endoscope in Vitro”, Endoscopy, 2001, 33(10), 849. |
12) N. Muguruma, S. Ito, T. Bando, S. Taoka, Y. Kusaka, S. Hayashi, S. Ichikawa, Y. Matsunaga, Y. Tada, S. Okamura, K. Ii, K. Imaizumi, K. Nakamura, K. Takesako and S. Shibamura, “Labeled Carcinoembryonic Antigen Antibodies Excitable by Infrared Rays: a Novel Diagnostic Method for Micro Cancers in the Digestive Tract”, Internal Medicine, 1999, 38(7), 537. |
13) T. Bando, N. Muguruma, S. Ito, Y. Musashi, K. Inayama, Y. Kusaka, M. Tadatsu, K. Ii, T. Irimura, S. Shibamura and K. Takesako, “Basic Study on a Labeled anti-mucin Antibody Detectable by Infrared-fluorescence Endoscopy”, J. Gastroenterol., 2002, 37, 260. |
14) N. Muguruma, S. Ito, S. Hayashi, S. Taoka, H. Kakehashi, K. Ii, S. Shibamura and K. Takesako, “Antibodies Labeled with Fluorescence-agent Excitable by Infrared Rays”, J. Gastroenterol., 1998, 33, 467. |
15) 伊藤進, 六車直樹,“不可視情報の画像化-新しい内視鏡診断学の展望 (5)赤外蛍光を用いた微小癌診断”, 臨牀消化器内科, 1999, 14(8), 1205. |
16) W. Aung, A. Tsuji, H. Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga, “Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model”, Molecular Imaging, 2016, 15, 1. |
特点:
● R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 也可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白,它的荧光强度要比化学荧光探针,如荧光素和罗丹明高得多。因此,用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。R-藻红蛋白(R-PE)是一种藻胆蛋白,它在578nm附近有橙色荧光,激发波长为488nm。R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH能够简便快速地制备被R-PE标记的IgG,SH-reactive R-PE(该试剂盒的成分之一)具有一个马来酰亚胺基,不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的巯基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube能够快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记所需的全部溶液,包括制备带有SH的还原型IgG所需的还原剂以及储存标记产物的Storage buffer。
*R-PE: R-Phycoerythrin(R-藻红蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中,IgG或者R-Phycoerythrin-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作步骤
(1)将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)用移液器使溶液混合,然后8,000-10,000g离心10分钟。b)
(3)将150μl WS buffer加入到Reducing agent中并用移液器吹打数次使其溶解。
(4)从步骤3所得的溶液中,取100μl转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
(5)用移液器吹打数次后,37℃培养30分钟。
(6)将100μl RA solution加入到管中,8,000-10,000g离心10分钟。弃滤液,加入200μl RA solution,再离心一次。b)
(7)将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive R-PE并吹打其溶解。
(8)将所得的SH-reactive R-PE溶液转移到被还原的IgG所集中的过滤管的膜上。
(9)用移液器吹打数次后,37℃培养1小时。
(10)加入150μl WS buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c)将该溶液转移至0.5ml试管中,在0-5℃下保存。d)
a)样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫,免疫印迹,免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个R-PE分子。没有被结合的R-PE可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话,可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d)通常R-PE标记后的IgG在Storage buffer中,0-5℃下至少能够保存2个月,如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇(终浓度:50%),并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1)R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50至200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)也可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6)带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
*还原剂经过优化,可减少IgG的制备。 当使用具有除IgG以外的S-S键的样品时,由于S-S键的断裂,标记分子的活性可能会丢失。请在确认不会发生因还原引起的失活后使用。
常见问题Q&A
Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗? |
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明,可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
Q2:在与IgG反应后,未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基? |
A:没有。反应过程中,活性酯基完全被水解了 |
Q3:标记小分子蛋白质(分子量50,000或以下)的方法 |
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器,因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质,并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时,可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质,如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长,因此请注意离心时间。 |
Q4:荧光蛋白分为三种,每种的波长特征是什么? |
A:别藻蓝蛋白(缩写:APC)激发波长:650nm发射波长:660nm
B-藻红蛋白(缩写:B-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm R-藻红蛋白(缩写:R-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm |
Q5:标记反应过程中,NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断,因此不会有低聚物生成。 |
Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗? |
A:可以,只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明,使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗? |
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer? |
A:是的,要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
Q10:标记产物能保存多久? |
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。 |
特点:
● R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
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试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白,它的荧光强度要比化学荧光探针,如荧光素和罗丹明高得多。因此,用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。R-藻红蛋白(R-PE)是一种藻胆蛋白,它在578nm附近有红色荧光,激发波长为488nm。R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2能够简便快速地制备被R-PE标记的IgG,NH2-reactive R-PE(该试剂盒的成分之一)具有一个活性的酯基团,不需任何活化能够轻易地与靶分子中的氨基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube用来快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了包括标记产物的储存液等用于R-PE标记的所需的全部试剂。
*R-PE: R-Phycoerythrin(R-藻红蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中,IgG或者R-Phycoerythrin-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作概述
(1)将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)8,000-10,000g离心10分钟后,加入100μl Washing buffer再离心一次。b)
(3)完成离心后,将10μl Reaction buffer加入到NH2-reactive R-PE中并用移液枪吹打使其溶解。
(4)将含有NH2-reactive R-PE的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
(5)用移液器吸取溶液吹洗净整个滤膜表面,然后将过滤管放入培养箱中,37℃培养2小时。
(6)将190μl WS buffer加入到过滤管中并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。c) 将溶液转移至0.5ml的试管中,并储存于0-5℃下。d)
a)样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫,免疫印迹,免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个R-PE分子。没有被结合的R-PE可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话,可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d)通常R-PE标记后的IgG在Storage buffer中,0-5℃下至少能够保存2个月,如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇(终浓度:50%),并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1)R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50至200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗? |
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明,可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
Q2:在与IgG反应后,未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基? |
A:没有。反应过程中,活性酯基完全被水解了 |
Q3:标记小分子蛋白质(分子量50,000或以下)的方法 |
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器,因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质,并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时,可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质,如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长,因此请注意离心时间。 |
Q4:荧光蛋白分为三种,每种的波长特征是什么? |
A:别藻蓝蛋白(缩写:APC)激发波长:650nm发射波长:660nm
B-藻红蛋白(缩写:B-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm R-藻红蛋白(缩写:R-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm |
Q5:标记反应过程中,NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断,因此不会有低聚物生成。 |
Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗? |
A:可以,只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明,使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗? |
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer? |
A:是的,要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
Q10:标记产物能保存多久? |
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
1) K.R. McCarthy, A. Watanabe, M. Kuraoka, K.T. Do, C.E. McGee, G.D. Sempowski, T.B. Kepler, A.G. Schmidt, G. Kelsoe and S.C. Harrison, “Memory B Cells that Cross-React with Group 1 and Group 2 Influenza A Viruses Are Abundant in Adult Human Repertoires”, Immunity., 2018, 48, (1), 174.
2) K.Y Su, A. Watanabe, C.H. Yeh, G. Kelsoe, M. Kuraoka, “Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs”, J. Immunol.., 2016, 197, (10), 4163.
3) T. Tsujikawa, T. Yaguchi, G. Ohmura, S. Ohta, A. Kobayashi, N. Kawamura, T. Fujita, H. Nakano, T. Shimada, T. Takahashi, R. Nakao, A. Yanagisawa, Y. Hisa, Y. Kawakami, “Autocrine and paracrine loops between cancer cells and macrophages promote lymph node metastasis via CCR4/CCL22 in head and neck squamous cell carcinoma”, Int. J. Cancer., 2013, 132, (12), 2755.
4) Y. Inaguma, Y. Akahori, Y. Murayama, K. Shiraishi, S. Tsuzuki-Iba, A. Endoh, J. Tsujikawa, A. Demachi-Okamura, K. Hiramatsu, H. Saji, Y. Yamamoto, N. Yamamoto, Y. Nishimura, T. Takahashi, K. Kuzushima, N. Emi, Y. Akatsuka, “Construction and molecular characterization of a T-cell receptor-like antibody and CAR-T cells specific for minor histocompatibility antigen HA-1H”, Gene Ther.., 2014, 21, (6), 575.
5) A. Watanabe, K. R. McCarthy, M. Kuraoka, A. G. Schmidt, Y. Adachi, T. Onodera, K. Tonouchi, T. M.Caradonna, G. Bajic, S. Song, C. E. McGee, G. D. Sempowski, F. Feng, P. Urick, T. B. Kepler, Y. Takahashi, S. C. Harrison, and G. Kelsoe, ‘Antibodies to a Conserved Influenza Head Interface Epitope Protect by an IgG Subtype-Dependent Mechanism.’, Cell.., 2019, 177, (5), 1124.
关联产品
特点:
● APC标记的产品可以在大约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50-200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 可以使用随附的保存溶液保存APC标签。
试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白,它的荧光强度要比化学荧光探针,如荧光素和罗丹明高得多。因此,用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。别藻蓝蛋白(APC)是一种藻胆蛋白,它在660nm附近有红色荧光,激发波长为488nm。Allophycocyanin Labeling Kit-SH能够简便快速地制备被APC标记的IgG,SH-reactive APC(该试剂盒的成分之一)具有一个马来酰亚胺基,不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的巯基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube能够快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记所需的全部溶液,包括制备带有SH的还原型IgG所需的还原剂以及储存标记产物的Storage buffer。
*APC: Allophycocyanin (别藻蓝蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中,IgG或者Phycobiliprotein-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作步骤:
(1)将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)用移液器使溶液混合,然后8,000-10,000g离心10分钟。b)
(3)将150μl WS buffer加入到Reducing agent中并用移液器吹打数次使其溶解。
(4)从步骤3所得的溶液中,取100μl转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
(5)用移液器吹打数次后,37℃培养30分钟。
(6)将100μl RA solution加入到管中,8,000-10,000g离心10分钟。弃滤液,加入200μl RA solution,再离心一次。b)
(7)将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive APC并吹打其溶解。
(8)将所得的SH-reactive APC溶液转移到被还原的IgG所集中的过滤管的膜上。
(9)用移液器吹打数次后,37℃培养1小时。
(10)加入150μl WS buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c)将该溶液转移至0.5ml试管中,在0-5℃下保存。d)
a)样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫,免疫印迹,免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个APC分子。没有被结合的APC可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话,可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d)通常APC标记后的IgG在Storage buffer中,0-5℃下至少能够保存2个月,如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇(终浓度:50%),并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1)APC标记的产品可以在大约2.5小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50-200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)还可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6)可以使用随附的保存溶液保存APC标签。
*还原剂针对减少IgG的制备而优化。当使用带有除IgG以外的S-S键的样品时,由于S-S键的断裂,可能会失去待标记分子的活性。请在确认不会发生因还原引起的失活后使用。
常见问题Q&A
Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗? |
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明,可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
Q2:在与IgG反应后,未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基? |
A:没有。反应过程中,活性酯基完全被水解了 |
Q3:标记小分子蛋白质(分子量50,000或以下)的方法 |
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器,因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质,并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时,可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质,如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长,因此请注意离心时间。 |
Q4:荧光蛋白分为三种,每种的波长特征是什么? |
A:别藻蓝蛋白(缩写:APC)激发波长:650nm发射波长:660nm
B-藻红蛋白(缩写:B-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm R-藻红蛋白(缩写:R-PE)激发波长:564nm发射波长:575nm |
Q5:标记反应过程中,NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断,因此不会有低聚物生成。 |
Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗? |
A:可以,只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明,使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗? |
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer? |
A:是的,要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
Q10:标记产物能保存多久? |
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。 |