特点：
● POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
● 可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● POD标记的产品只需与SH反应过氧化物酶混合即可形成。
● 还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● POD标签可与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析（EIA）所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive peroxidase能够与含有巯基的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive peroxidase可以和靶分子形成共价键，还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时，SH-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。
原理
操作步骤
使用注意事项:
1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。
2.所需标记的较小的巯基化合物的分子量要<5,000。
3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化（不包含于此试剂盒中）。
5.如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。
6.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶SH -reactive peroxidase放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl Solution A以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）用移液器使溶液混合，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将100μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养30分钟。
（6）将100μl Solution B加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟。除去滤液，加入200μl Solution B，再离心一次。b）
（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。
（8）将SH-reactive peroxidase溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（9）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养1小时。
（10）将100μl Solution A加入到试管中，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（11）加入200μl Storage buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管，并储存于0-5℃。
a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。如果在聚积过程中，滤液体积超过了400μl，则需在进行下一步离心前将滤液除去。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上会被标记 上1到2个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常辣根过氧化物酶标记后的还原型IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。另外，还要注意样品自身是否稳定。
标记小分子操作步骤：
（1）用Reaction buffer制备50μl，1 mM的巯基化合物溶液，a）并将该溶液加入到SH-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。
（2）将100μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
（3）在8,000-10,000g离心10分钟，b）弃滤液，向管中加入200μl Solution A。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。b）
（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10-15次来回收抗体。c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）如果巯基化合物无法在水溶液中溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl 与45μl Reaction buffer混合。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1到2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。
d）标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。
产品优势
1）POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）POD标记的产品只需与SH反应过氧化物酶混合即可形成。
5）还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
7）POD标签可与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1: 能够使用这个试剂盒标记F(ab’)2吗？ |
| A:可以标记。请参照标记IgG的操作说明，回收率通常都超过80%。 |
| Q2: 能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
| A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000或者<5,000且具有活性巯基结构。如果分子量.>50,000，参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品用 LK09-10来标记。如果分子量<5,000，参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000，请咨询我们的客户服务。Email：info@dojindo.cn 免费电话 ：800-988-0083 |
| Q3: 能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:可以，只要它的分子量小于5,000且具有活性巯基。可以参照标记小分子的操作说明。 |
| Q4:LK09所能标记的最小的IgG的量是多少？ |
| A:最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG，在灵敏度和本底上没有太大的区别。但是，在步骤8，使用SH-reactive peroxidase溶液时，用量缩小为原来的1/5，也能够标记10 μg的IgG。 |
| Q5: 每个IgG能够标记多少辣根过氧化物酶分子？ |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个辣根过氧化物酶分子。 |
| Q6:标记蛋白质之前是否必须先使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性巯基的小分子并且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右，则没有必要使用过滤管。只需要将样品溶液和Solution B混合，再把混合液加入到SH-reactive peroxidase管中即可。 |
| Q7:是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer？ |
| A:不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该试验的缓冲液。但是，Storage Buffer能够提高标记产物的稳定性。 |
| Q8:我的样品中含有小的不溶物，我该怎么办？ |
| A:低速离心后用上清液来标记。 |
| Q9:标记反应结束后，未标记的SH-reactive peroxidase是否仍然含有活性马来酰亚胺？ |
| A:不含有。几乎100%的SH-reactive peroxidase都被用于了IgG或者小分子的标记。 |
| Q10:Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物？ |
| A:Storage Buffer中不含有任何动物产品，高分子聚合物或者重金属离子。 |
参考文献
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