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・Calcein-AM Reagent                             200 μg x 1        1 mg x 1

・PI Stock Solution (1.5 mmol/l)              200 μl x 1         1 ml x 1

・DMSO                                                    200 μl x 1         1 ml x 1

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒内含两种染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团，产生的Calcein (钙黄绿素) 发出强绿色荧光，因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，因此死细胞会被检测到红色荧光。除了用荧光显微镜外，也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。

Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm

PI : λex=530 nm , λem=580 nm

                                                                           细胞染色实例

（a）                                     （b）                                      （c）

a)  Calcein-AM染FTC细胞（活细胞单染）

b)  PI染HCT116细胞（死细胞单染）

c)  Calcein-AM、PI染MHD-1 细胞（活死细胞双染）

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。

Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度：

1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。

2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

以HeLa细胞为例

制备1 mmol/l的Calcein-AM储存液

【500 次】

将200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

【3000 次】

将1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

※Calcein-AM储存液需要避光，在-20℃密封保存。

制备染色工作液

将Calcein-AM储存液和PI储存液恢复至室温后使用。

在5 ml的PBS（-）中加入10 μl Calcein-AM储存液和15 μl PI储存液，混匀制成工作液。此时Calcein-AM的浓度为2 μmol/l，而PI的浓度为4.5 μmol/l。

染色步骤

1、 用Trypsin-EDTA消化细胞。

2、 通过离心收集细胞（1,000 rpm，3 min）。

3、 去除上清液，加入PBS（-）制备细胞悬液（10⁵ – 10⁶ cells/ml为宜）。

4、 重复步骤2和步骤3数次以消除培养基中的酯酶活性。

5、 取100 μl 染色工作液与200 μl 细胞悬液混合，在37℃培养15 min。

6、 在490±10 nm激发波长下同时观察黄绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞。另外用545 nm激发波长单独观察死细胞。

1、 由于本试剂盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先涡旋以使其振落下来。

2、 由于Calcein-AM储存液对潮气敏感，请在使用后密闭Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成10 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

3、 配制好的染色工作液请在当天使用。

4、 PI有疑似致癌性，使用前应注意以下几点：

1） 使用时请带好手套，口罩，防护眼镜等，不要接触到或呼吸到。

2） 当PI不慎接触到皮肤时，请立刻用大量的水冲洗。

3） 处理方法

清洗容器的清洗液和废液请按照实验室的有毒有害物质的处理方法进行处理，或按照以下方法处理：

・用UV照射的方法进行分解

・用次氯酸钠氧化分解后，进行中和处理

1. A novel photothermally controlled multifunctional scaffold for clinical treatment of osteosarcoma and tissue regeneration,

Materials Today, 2020, doi.org/10.1016/j.mattod.2019.12.005

2. Mitochondria-Targeted Artificial “Nano-RBCs” for Amplified Synergistic Cancer Phototherapy by a Single NIR Irradiation,

Advanced Science, 2018, 5, 1800049

3. 4D-Printed Biodegradable and Remotely Controllable Shape Memory Occlusion Devices,

Advanced Functional Materials, 2019, 29(51), 1906569

4. Magnetic Hyperthermia-Synergistic H2O2 Self-Sufficient Catalytic Suppression of Osteosarcoma with Enhanced Bone-Re

generation Bioactivity by 3D-Printing Composite, Advanced Functional Materials, 2019, 1907071

5. A Substitution-Dependent Light-Up Fluorescence Probe for Selectively Detecting Fe3+ Ions and Its Cell Imaging Application,

Advanced Functional Materials, 2018, 28(35), 1802833

6. An Extendable Star-Like Nanoplatform for Functional and Anatomical Imaging-Guided Photothermal Oncotherapy,

ACS Nano, 2019, 13(4), 4379-4391

7. Near-Infrared Light-Triggered Sulfur Dioxide Gas Therapy of Cancer, ACS Nano, 2019, 13(2), 2103-2113

8. Nanoenzyme-Augmented Cancer Sonodynamic Therapy by Catalytic Tumor Oxygenation,

ACS Nano, 2018, 12(4), 3780-3795

9. Terrylenediimide-Based Intrinsic Theranostic Nanomedicines with High Photothermal Conversion Efficiency for Photoacoustic

Imaging-Guided Cancer Therapy, ACS Nano, 2017, 11(4), 3797-3805

10. Two-Dimensional Graphene Augments Nanosonosensitized Sonocatalytic Tumor, ACS Nano, 2017, 11(9), 9467-9480

11. Multifunctional Bismuth Selenide Nanocomposites for Anti-Tumor Thermo-Chemotherapy and Imaging,

ACS Nano, 2016, 10(1), 984-97

12. Molecular Responses of Human Lung Epithelial Cells to the Toxicity of Copper Oxide Nanoparticles Inferred from Whole

Genome Expression Analysis, ACS Nano, 2011, 5(12), 9326–9338

13. Living functional hydrogels generated by bioorthogonal cross-linking reactions of azidemodified cells with alkyne-modified

polymers, Nature Communications, 2018, 9, 2195

14. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds,

Nature Communications, 2019, 10(1), 2060

15. Magnetic-responsive and targeted cancer nanotheranostics by PA/MR bimodal imaging-guided photothermally triggered

immunotherapy, Biomaterials, 2019, 219, 119370

16. Oriented collagen fiber membranes formed through counter-rotating extrusion and their application in tendon regeneration,

Biomaterials, 2019, 207, 61-75

17. Triple-functional polyetheretherketone surface with enhanced bacteriostasis and anti-inflammatory and osseointegrative

properties for implant application, Biomaterials, 2019, 212, 98-114

18. Ultrasmall Cu2-xS nanodots as photothermal-enhanced Fenton nanocatalysts for synergistic tumor therapy at NIR-II

biowindow, Biomaterials, 2019, 206, 101-114

19. Theranostic 2D ultrathin MnO2 nanosheets with fast responsibility to endogenous tumor microenvironment and exogenous

NIR irradiation, Biomaterials, 2018, 155, 54-63

20. Cooption of heat shock regulatory system for anhydrobiosis in the sleeping chironomid Polypedilum vanderplanki,

Proc. Natl. Acad. Sci., 2018, 115(10), E2477-E2486

21. Wnt Inhibitor Dickkopf-1 as a Target for Passive Cancer Immunotherapy,

Cancer Research, 2010, 70(13), 5326-36

22. Gadolinium polytungstate nanoclusters: a new theranostic with ultrasmall size and versatile properties for dual-modal MR/CT

imaging and photothermal therapy/radiotherapy of cancer, NPG Asia Material, 2016, 8, e273

23. 2D Superparamagnetic Tantalum Carbide Composite MXenes for Efficient Breast-Cancer Theranostics,

Theranostics, 2018, 8(6), 1648-1664

24. Connexin43 Hemichannels Contribute to Cadmium-Induced Oxidative Stress and Cell Injury,

Antioxidants & Redox Signaling, 2011, 14(12), 2427-39

25. Synthesis and characterization of hierarchically macroporous and mesoporous CaO-MO-SiO2-P2O5(M=Mg,Zn,Sr) bioactive

glass scaffolds, Acta Biomaterialia, 2011, 7(10), 3638-3644

细胞膜起着分隔细胞内和细胞外的作用，并且与细胞的移动和生长、神经信号的传达等细胞功能密切相关。因此，细胞膜的异常与各种细胞状态异常所造成的疾病（如离子通道病Channelopathy）有很密切的关联，被认为是非常重要的生物标记物之一。

由于操作简便并且可用于活细胞染色，小分子荧光探针是最常用的细胞膜染色方法。但是小分子荧光探针普遍存在细胞内停留时间短、水溶性差的问题。而PlasMem Bright是一种克服了现有小分子荧光探针问题的产品。 用PlasMem Bright观察细胞膜时，可以在染色后的1天以上进行长时间的荧光观察。

PlasMem Bright系列产品克服了现有市面上的细胞膜染色试剂的诸多缺点（细胞毒性高、停留时间短、不同实验系的兼容性差）。并且分别有Green/ Red两种产品，方便多重染色时自由选择。

*通过细胞核染色试剂染色后，神经细胞的形态变化(凝集)的比较得出的结论

使用各种细胞膜染色试剂进行染色HeLa细胞，经过24 h培养后对各染色试剂的荧光图像进行比较。结果发现，与其他公司的细胞膜染色试剂相比，PlasMem Bright系列产品的染色时间更长，膜上的停留时间也更长。

实验例：ES细胞群内部的细胞膜染色

将小鼠ES细胞在涂有明胶的玻璃底皿中培养4天，并将获得的细胞群，用PlasMem Bright Green（200倍稀释）染色15分钟，并使用共聚焦显微镜（Zeiss：LSM710）中观察。

结果，细胞群内部的细胞膜也可以用PlasMem Bright Green可视化观察。

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm.

*此实验例由庆应义塾大学医学院的石津 大嗣老师提供。

实验例：轴突神经细胞形态和线粒体定位的观察

由神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分化诱导的神经细胞，分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 进行染色。可以鲜明的观察到细胞的形状以及轴突内的线粒体。

（比例尺：200 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）诱导神经芽细胞（SH-SY5Y）为神经细胞。

（2）去除上清液，添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养30分钟。

（4）去除上清液，添加HBSS。

（5）使用荧光显微镜观察。

实验例：神经芽细胞（SH-SY5Y）中的线粒体检测

分别用PlasMem Bright Green (绿)、MitoBright LT Red (红)、Hoechst 33342 (蓝) 对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行染色，用共聚焦显微镜获得3D图像。可以鲜明的观察到细胞形态以及线粒体和细胞核的情况。

（比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜（PlasMem Bright Green【绿】）：Ex.488 nm/Em.500-560 nm。

线粒体（MitoBright LT Red【红】）：Ex.561 nm/Em.560-620 nm。

细胞核（Hoechst33342【蓝】）：Ex.405 nm/Em.400-450 nm。

<实验步骤>

（1）使用HBSS清洗SH-SY5Y细胞。

（2）添加使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green、Hoechst 33342（终浓度：5μg/ml）以及MitoBright LT Red（终浓度0.1 μmol/l）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞2次

（5）使用荧光显微镜观察。

  实验例：脑源性小鼠神经母细胞瘤的延时成像

使用培养基中稀释200倍的PlasMem Bright Green，染色N1E-115细胞30分钟并进行延时成像时，可以清楚地观察到神经细胞内树突和突起中的变化。

<培养条件>

・细胞：N1E-115细胞（脑源性小鼠神经母细胞瘤）

・培养基：5％FBS，1％含谷氨酰胺的D-MEM（低葡萄糖）

・培养设备：35 mm 玻璃底皿

<拍摄条件>

・成像设备：带培养箱的荧光显微镜

・拍摄时间：1小时，拍摄间隔：2分钟

*此实验例由芝浦理工大学系统科学与工程学院的涌澤 充 様、福井 浩二教授提供。

 实验例：与外泌体共染色

向PlasMem Bright Green染色的HeLa细胞中加入外泌体膜荧光染色试剂盒(ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red)染色的外泌体。可以观察到，由活细胞的细胞膜产生的内体(Endosome)中的外泌体，以及没有摄入外泌体的内体。另外，即使在固定染色的细胞之后，也可以像活细胞一样使存在于细胞膜来源的囊泡（内体）中的外泌体可视化。

(比例尺：5 μm）

(比例尺：10 μm）

<观察条件>

细胞膜 (PlasMem Bright Green, 绿)  Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm。

外泌体 (ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red, 红)  Ex. 561 nm / Em. 560-620 nm。

<实验步骤>

（1）接种Hela细胞，24小时培养。

（2）去除上清液，添加使用培养基稀释的PlasMem Bright Green（100倍稀释）。

（3）培养10分钟。

（4）使用HBSS清洗细胞3次。

（5）添加175 μlMEM培养基与ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red染色过的Exosome溶液25 μl。

（6）在CO₂培养箱中过夜培养。

（固定情况下）细胞使用HBSS清洗2次后添加4%PFA，培养15分钟后，使用HBSS清洗细胞2次。

（7）使用共聚焦显微镜观察

 实验例：烟草BY2细胞的膜染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色烟草BY2细胞5分钟，清洗后每5分钟拍摄一次并进行长时间观察。实验中可以清晰的观察到BY2细胞膜的荧光以及细胞分裂所形成的细胞板。

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

・转盘式共聚焦显微镜观察

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

・图中的时间按照00:00 (小时:分钟)表示

 实验例：拟南芥根的染色

用PlasMemBright Green (200倍稀释)染色拟南芥根15分钟，采用Z轴景深连续拍照的方法进行荧光观察，可以清晰的观察到立体的细胞膜分布情况。

(数据由名古屋大学栗原大辅老师友情提供)

<检测条件>

・转盘式共聚焦显微镜观察，Z轴摄影

・Ex: 488 nm; Em: 520/35 (502.5-537.5 nm)

近年来研究发现，外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非 常重要，然而目前广泛使用的磷脂双分子层的荧光染料存在明显的缺点（1. 染色后外泌体粒径增大。2. 荧光染料自身形成粒子，造成背景增高）。本产品是为了解决这些问题而开发的新型荧光染料，并且有 Green, Red, Deep Red 三种颜色，可满足多重染色在内的各种实验需求。

特点1：外泌体的标记和纯化一步到位 

ExoSparkler系列已经对外泌体标记的最佳条件进行摸索并做成了操作手册，试剂盒内包含纯化所需的过滤管，可以简单快捷的进行外泌体的标记和纯化。

纯化方法(未反应染料的去除)的比较

ExoSparklar系列中用于除去未反应染料的过滤管，与以往使用的相同用途的凝胶过滤法相比，能够以更高的回收率纯化外泌体。

关于使用过滤管进行纯化的有效性，常见问题是：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？详见Q&A。

特点2：多种颜色选择 

ExoSparkler系列包括膜 (Mem Dye)和蛋白质 (Protein Dye)荧光染色试剂，各三种颜色 (Green, Red, Deep Red)。

■实验条件

超速离心法纯化的外泌体(蛋白质的量为10 μg)经过各试剂染色后，与HeLa细胞(1.25×10⁴ cells)一起培养24 h，清洗后进行荧光观察。

■观察条件

Green:

Ex： 488 nm / Em： 490-540 nm

Red:

Ex： 561 nm / Em： 570-640 nm

Deep Red:

Ex： 640 nm / Em： 640-760 nm

实验例：确认外泌体的局部存在

将用ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red(产品名称：EX06，Protein Dye-Deep Red)或ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red(产品名称：EX02，Mem Dye-Red)染色的外泌体添加到HeLa细胞中，通过与溶酶体染色试剂(绿色)共染确认了外泌体在细胞内的定位。结果证实，用蛋白质或膜染色的外泌体均位于溶酶体中。

观察条件 

Protein Dye-Deep Red（紫）：Ex：640 nm / Em：640-760 nm

Mem Dye-Red（红色）：Ex：561 nm / Em：570-640 nm

溶酶体染色试剂（绿）：Ex：488 nm / Em：490-540 nm

实验条件

将用超速离心法提取的外泌体(蛋白质量为5 µg)用每个外泌体染色试剂盒染色，添加到HeLa细胞(0.75×10⁴cells)中，孵育3.5小时后对溶酶体进行染色，观察洗涤后的荧光图像。

① Exosome + Buffer

② Only Buffer

Fluorescent images at 4 h incubation

Detection conditions

Green：Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm

Red ：Ex 561 nm / Em 570 – 640 nm

Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm