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铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489 铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)

发表于由
铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

● 定位线粒体

● 更深层次铁离子探究

下载说明书
产品文献
宣传资料下载
选择规格：
50μg*2
现货
 
铁死亡检测方案
产品概述
测定原理
产品特点
实验例
参考文献
常见问题Q&A
规格性状

产品概述

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的 永澤秀子 和 平山祐 博士的指导下开发。Mito-FerroGreen和Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆，与Fluo-3（货号：F019）这类可以实时监测钙离子的荧光探针有所不同。

测定原理

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产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

 

FerroOrange Mito-FerroGreen
细胞内分布 细胞内 线粒体
荧光特性 λex : 543 nm、λem : 580 nm λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器 荧光显微镜 荧光显微镜 （FITC、GFP）
（滤镜）
检测对象 活细胞 活细胞
染色次数 24 μg可染色35 mm dish 17块板 50 μg可染色35 mm dish 5块板
（终浓度 1 μmol/l時） （终浓度 5 μmol/l時）

实验例

1.线粒体定位

为了确认Mito-FerroGreen的是否特异性地在线粒体内定位，与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red※）一同进行染色，实验结果证实了Mito-FerroGreen选择性地染色在线粒体内。

向HeLa细胞中添加5μmol/ l的Mito-FerroGreen和200 nmol/l的线粒体染色探针MitoBright Deep Red，并在CO2培养箱中培养30分钟，然后添加100μmol/ l的硫酸铁铵（II），并将混合后的细胞溶液在CO2培养箱中培养1小时后通过观察荧光。

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Mito-FerroGreen

激发波长：488 nm

发射波长：500-565 nm

MitoBright Deep Red

激发波长：640 nm

发射波长：656-700 nm

2.线粒体内的铁离子荧光成像

在含有血清的MEM培养基中接种HeLa细胞，并加入Mito-FerroGreen，通过荧光检测HeLa细胞众线粒体内的二价铁（左图）。而在添加了铁离子的HeLa细胞中，观察到了Mito-FerroGreen的荧光明显增强（中间图）。在添加了铁螯合剂的细胞中，几乎未观察到Mito-FerroGreen的荧光（右图）。 以这种方式，证实了线粒体中铁含量的差异和荧光强度的差异是成相关性的。

image.png

3.对二价铁离子的高度选择性和高信号

向1ml 50mmol/l HEPES Buffer（pH7.4）中加入2μl 1mol/l Mito-FroGreen、2μl 10mmol/l各种金属以及20μl 1mg/ml酯化酶，在室温下反应1小时后测定荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

image.png

4.适用于通用滤光片

Mito-FerroGreen的激发波长为488nm，最大激发波长可达505nm。

向3ml 50 mmol/l HEPES Buffer (pH7.4) 中加入 6μl 1mol/l Mito-FroGreen、6μl 10mmol/l硫酸铵铁（Ⅱ）以及20μl 1mg/ml酯化酶。在37℃下反应1小时后检测荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

image.png

参考文献

1) T. Hirayama,  S. Kadota, M. Niwa  and  H. Nagasawa, “A mitochondria-targeted fluorescent probe for selective detection of mitochondrial labile Fe(II)”, Metallomics., 2018, DOI: 10.1039/C8MT00049B

2) T. Issitt, E. Bosseboeuf, N. Winter, N. Dufton, G. Gestri, V. Senatore, A. Chikh, A. Randi, C. Raimondi, “Neuropilin-1 controls endothelial homeostasis by regulating mitochondrial function and iron-dependent oxidative stress via ABCB8”, iScience., 2018,DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.005 .

3) E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 “, J Physiol Sci., 2018,doi:10.1007/s12576-018-0652-2.

4) M. Fujimaki, N. Furuya, S. Saiki, T. Amo, Y. Imamichi and N. Hattori, “Iron supply via NCOA4-mediated ferritin degradation maintains mitochondrial functions”, Mol. Cell. Biol.., 2019,doi: 10.1128/MCB.00010-19.

5) K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem Biophys Res Commun.., 2019,doi: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.

6) Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264, doi: 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

7) KF. Yambire, C. Rostosky, T. Watanabe, D. Pacheu-Grau, S. Torres-Odio,A. Sanchez-Guerrero,O. Senderovich, EG. Meyron-Holtz,I.Milosevic, J. Frahm, AP. West and N. Raimundo, “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo.”, Elife, 2019, 3, (8), doi:10.7554/eLife.51031.

8) H. Nishizawa, M. Matsumoto, T. Shindo, D. Saigusa, H. Kato, K. Suzuki, M. Sato, Y. Ishii, H. Shimokawa and K. Igarashi, “Ferroptosis is controlled by the coordinated transcriptional regulation of glutathione and labile iron metabolism by the transcription factor BACH1″,  J. Biol. Chem.,  2019,doi: 10.1074/jbc.RA119.009548.

9)Y. akashima, A. Hayano and B. Yamanaka, Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells.”, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

常见问题Q&A

Q1：是否可以对酵母进行染色吗？
A1：我们公司有酵母染色的实验例，染色的具体实验步骤请联系我们公司的销售人员。
Q2：推荐使用的滤光片波长是多少？
A2：检测时推荐的滤光片如下：

激发波长：450~500 nm

发射波长：515~550 nm

规格性状

性状：本品溶于乙腈、甲醇、二甲醇。

纯度（HPLC）：90.0%以上

荧光光谱：适合测试

二价铁离子检测探针—FerroOrange F374 细胞内二价铁离子检测

发表于由

二价铁离子检测探针—FerroOrange F374 细胞内二价铁离子检测

氧化应激与自由基

氧是合成激素和ATP等生物活性物质的一种重要的分子。获得利用氧的能力是生命进化的重要的驱动力。氧可以激活细胞中的各种酶，被激活的氧种类涉及细胞功能的运作。尽管氧本身是生命的一个基本元素，但在氧化应激中，诸如DNA和蛋白质等细胞中的分子有时会被活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 破坏。
抗氧化能力
活性氧
谷胱甘肽
DNA损伤
脂质过氧化物
铁离子
谷氨酰胺、谷氨酸
自由基
NO研究

品名货号用途

二价铁离子检测探针—FerroOrange F374 细胞内二价铁离子检测
Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒 I291 组织总铁含量及二价铁含量检测
铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen M489 线粒体内二价铁离子检测

细胞中的氧化应激是由代谢、电离辐射和与DNA直接相互作用的致癌化合物产生的ROS导致的。在代谢的过程中，小部分的氧由于一个电子的还原变成超氧阴离子，接着超氧阴离子被超氧化物岐化酶 (SOD) 转变成氧气和过氧化氢。过氧化氢由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶还原成水。然而如果过氧化氢并没有被这些酶完全还原，当它被铁(Fenton反应)氧化将产生反应性极强的羟自由基。羟自由基还可以由紫外线照射产生或直接电离辐射水产生。羟自由基可以与脂反应产生脂质过氧化物。然而并非所有ROS都是有害的。次氯酸盐离子是一种由中性粒细胞的髓过氧化物酶产生的过氧化氢衍生而来的ROS，它具有杀菌活性。NO也称为内皮来源的舒张因子，它是由NO合成酶产生的。不过NO和超氧阴离子反应可产生具有细胞毒性的过氧亚硝基阴离子。ROS和活性氮化合物在生物系统中具有许多不同的活性。相应地好氧生物会产生防止氧化应激的防御机制。最近在对防御机制以及氧化损伤与疾病或老化过程之间关系的研究中，氧化应激已成为许多研究的焦点。最终已发展出许多用于检测ROS相关或ROS来源的物质的方法，这些物质包括超氧阴离子、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、DNA损伤、8-氧基鸟嘌呤、8-硝基鸟嘌呤和蛋白质羰基等。1611283113679630.png

铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489

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铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen货号：M489
铁死亡荧光试剂 (Fe2+荧光法)
Mito-FerroGreen
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温

特点：

 

● 对二价铁离子的高度选择性和高灵敏度

● 适用于通用滤光片

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50μg*2
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铁死亡检测方案
产品概述
测定原理
产品特点
实验例
参考文献
常见问题Q&A
规格性状

产品概述

研究证实铁是生物体内量最多的过渡金属元素。其参与多种生理活动。近几年，细胞内的游离铁离子由于具有很高的反应性，和细胞损伤、死亡有一定的关联而得到了越来越多的关注。在细胞内游离铁离子以稳定的Fe2+和 Fe3+形式存在。从细胞内的还原环境，金属转运体及Fe2+的水溶性考虑，认为揭示细胞内Fe2+的行为比Fe3+更重要。Mito-FerroGreen是一种新型荧光探针，用于检测线粒体 (铁硫簇和血红素蛋白的合成场所) 内亚铁离子Fe2+。

该产品已在岐阜药科大学药物化学实验室的 永澤秀子 和 平山祐 博士的指导下开发。Mito-FerroGreen和Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆，与Fluo-3（货号：F019）这类可以实时监测钙离子的荧光探针有所不同。

测定原理

image.png

产品特点

铁离子检测试剂的选择

可以根据自己的实验方法和实验仪器选择检测试剂

 

FerroOrange Mito-FerroGreen
细胞内分布 细胞内 线粒体
荧光特性 λex : 543 nm、λem : 580 nm λex : 505 nm、λem : 535 nm
检测仪器 荧光显微镜 荧光显微镜 （FITC、GFP）
（滤镜）
检测对象 活细胞 活细胞
染色次数 24 μg可染色35 mm dish 17块板 50 μg可染色35 mm dish 5块板
（终浓度 1 μmol/l時） （终浓度 5 μmol/l時）

实验例

1.线粒体定位

为了确认Mito-FerroGreen的是否特异性地在线粒体内定位，与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red※）一同进行染色，实验结果证实了Mito-FerroGreen选择性地染色在线粒体内。

向HeLa细胞中添加5μmol/ l的Mito-FerroGreen和200 nmol/l的线粒体染色探针MitoBright Deep Red，并在CO2培养箱中培养30分钟，然后添加100μmol/ l的硫酸铁铵（II），并将混合后的细胞溶液在CO2培养箱中培养1小时后通过观察荧光。

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Mito-FerroGreen

激发波长：488 nm

发射波长：500-565 nm

MitoBright Deep Red

激发波长：640 nm

发射波长：656-700 nm

2.线粒体内的铁离子荧光成像

在含有血清的MEM培养基中接种HeLa细胞，并加入Mito-FerroGreen，通过荧光检测HeLa细胞众线粒体内的二价铁（左图）。而在添加了铁离子的HeLa细胞中，观察到了Mito-FerroGreen的荧光明显增强（中间图）。在添加了铁螯合剂的细胞中，几乎未观察到Mito-FerroGreen的荧光（右图）。 以这种方式，证实了线粒体中铁含量的差异和荧光强度的差异是成相关性的。

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3.对二价铁离子的高度选择性和高信号

向1ml 50mmol/l HEPES Buffer（pH7.4）中加入2μl 1mol/l Mito-FroGreen、2μl 10mmol/l各种金属以及20μl 1mg/ml酯化酶，在室温下反应1小时后测定荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

image.png

4.适用于通用滤光片

Mito-FerroGreen的激发波长为488nm，最大激发波长可达505nm。

向3ml 50 mmol/l HEPES Buffer (pH7.4) 中加入 6μl 1mol/l Mito-FroGreen、6μl 10mmol/l硫酸铵铁（Ⅱ）以及20μl 1mg/ml酯化酶。在37℃下反应1小时后检测荧光强度。

激发波长：500 nm

发射波长：535 nm

image.png

参考文献

1) T. Hirayama,  S. Kadota, M. Niwa  and  H. Nagasawa, “A mitochondria-targeted fluorescent probe for selective detection of mitochondrial labile Fe(II)”, Metallomics., 2018, DOI: 10.1039/C8MT00049B

2) T. Issitt, E. Bosseboeuf, N. Winter, N. Dufton, G. Gestri, V. Senatore, A. Chikh, A. Randi, C. Raimondi, “Neuropilin-1 controls endothelial homeostasis by regulating mitochondrial function and iron-dependent oxidative stress via ABCB8”, iScience., 2018,DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.005 .

3) E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 “, J Physiol Sci., 2018,doi:10.1007/s12576-018-0652-2.

4) M. Fujimaki, N. Furuya, S. Saiki, T. Amo, Y. Imamichi and N. Hattori, “Iron supply via NCOA4-mediated ferritin degradation maintains mitochondrial functions”, Mol. Cell. Biol.., 2019,doi: 10.1128/MCB.00010-19.

5) K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem Biophys Res Commun.., 2019,doi: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.

6) Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264, doi: 10.1016/j.envpol.2019.07.105.

7) KF. Yambire, C. Rostosky, T. Watanabe, D. Pacheu-Grau, S. Torres-Odio,A. Sanchez-Guerrero,O. Senderovich, EG. Meyron-Holtz,I.Milosevic, J. Frahm, AP. West and N. Raimundo, “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo.”, Elife, 2019, 3, (8), doi:10.7554/eLife.51031.

8) H. Nishizawa, M. Matsumoto, T. Shindo, D. Saigusa, H. Kato, K. Suzuki, M. Sato, Y. Ishii, H. Shimokawa and K. Igarashi, “Ferroptosis is controlled by the coordinated transcriptional regulation of glutathione and labile iron metabolism by the transcription factor BACH1″,  J. Biol. Chem.,  2019,doi: 10.1074/jbc.RA119.009548.

9)Y. akashima, A. Hayano and B. Yamanaka, Metabolome analysis reveals excessive glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK signaling in methotrexate-resistant primary CNS lymphoma-derived cells.”, Clin. Cancer Res., 2020, DOI:10.1158/1078-0432.

常见问题Q&A

Q1：是否可以对酵母进行染色吗？
A1：我们公司有酵母染色的实验例，染色的具体实验步骤请联系我们公司的销售人员。
Q2：推荐使用的滤光片波长是多少？
A2：检测时推荐的滤光片如下：

激发波长：450~500 nm

发射波长：515~550 nm

规格性状

性状：本品溶于乙腈、甲醇、二甲醇。

纯度（HPLC）：90.0%以上

荧光光谱：适合测试

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二价铁离子检测探针—FerroOrange F374 细胞内二价铁离子检测

发表于由

铁死亡的发生

在细胞中有大量的脂质组成细胞膜，细胞膜上的脂质会以大量磷脂的形式存在，细胞内的脂质会分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，在氧分子和铁离子的存在下，多不饱和脂肪酸的增加容易被氧化而产生脂质过氧化物，有更多的不饱和脂肪酸的情况下，会更容易扩散，引起细胞膜损伤，也就是我们说的铁死亡。但是正常的细胞是可以调控这种细胞膜损伤，也就是我们常说的GPX4通路等等抗氧化系统，所以细胞才能在氧化物质存在的情况下，仍然可以存活。

二价铁离子检测探针—FerroOrange F374 细胞内二价铁离子检测
Iron Assay Kit -Colorimetric-试剂盒 I291 组织总铁含量及二价铁含量检测
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二价铁离子检测探针—FerroOrange货号：F374

发表于由
二价铁离子检测探针—FerroOrange货号：F374
细胞亚铁离子检测荧光探针
FerroOrange
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 荧光法高敏检测胞内二价铁

● 适合于多种检测仪器

● 铁死亡常见指标之一

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铁死亡通路图
选择规格：
1 tube
3 tubes
现货 
 
高灵敏度
操作简便
活细胞检测
更多铁死亡检测方案
活动进行中
规格性状
产品概述
原理
荧光特性
铁离子试剂的选择
与其他染料共染
操作步骤
高灵敏度检测胞内铁离子
使用流式细胞仪检测
常见问题Q&A
参考文献

活动进行中

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NO.4.    Mito-FerroGreen    线粒体内亚铁离子检测

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规格性状

性状：可溶于乙腈，甲醇和二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：92.0%以上

荧光光谱：符合一致性

产品概述

铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。 近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注， 游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe2+) 和铁离子 (Fe3+)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe2+的水溶性时，了解Fe2+的行为比了解Fe3+的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe2+进行荧光成像。

原理

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FerroOrange检测胞内Fe2+

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图为将2 μl的1 mmol/l FerroOrange和2 μl的10 mmol/l的各种金属离子添加到1 ml的50 mmol/l HEPES缓冲液（pH 7.4）中，并在室温下反应1小时后测量的荧光强度。

荧光特性

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Ex：543 nm   Em：580 nm

铁离子试剂的选择

           FerroOrange          Mito-FerroGreen
 存在部位                      细胞内                      线粒体
 荧光特性    λex : 543 nm、λem : 580 nm    λex : 505 nm、λem : 535 nm
 检测仪器    荧光显微镜、荧光酶标仪（Cy3）       荧光显微镜（FITC、GFP）
 测定对象                   活细胞                  活细胞
 检测次数      24μg可染色17次35mm dish
（终浓度为1μmol/l）		      50μg可染色5次35mm dish
（终浓度为5μmol/l）

与其他染料共染

FerroOrange与各种细胞内的染色试剂共染

用各种染色试剂染色HeLa细胞，清洗细胞。然后将FerroOrange添加到细胞中，并用荧光显微镜观察。

与ER染色试剂共染 

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

ER Tracker Green（ER染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

1612748348946869.png

与线粒体染色试剂共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

MitoBright Deep Red（线粒体染色试剂）: Ex: 640 nm、Em: 650-700 nm

标尺: 10 μm

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与高尔基体染色试剂的共染

＜检测条件＞

FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm

BODIPY FL（高尔基体染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm

标尺: 10 μm

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操作步骤

1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。

2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。

* 请根据药物特性优化孵育时间。

4.加入浓度为1 μmol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。

* 加入FerroOrange染色剂后请立即观察，不要洗涤。

5.在荧光显微镜下观察细胞。

高灵敏度检测胞内铁离子

使用HeLa细胞，通过FerroOrange确认细胞内Fe2+的变化

与对照组的细胞相比，用硫酸亚铁 (II) 铵处理的HeLa细胞的FerroOrange荧光强度增加。 相反，在用Bpy处理的细胞中，其荧光强度降低。

因此，证明FerroOrange与细胞内Fe2+反应。

A: 对照组

B: 铁剂·硫酸亚铁(II) 铵（终浓度100umol/l）处理

C: 铁螯合剂·2,2′-Bipyridyl (Bpy)（终浓度100umol/l）处理

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检测条件 Ex/Em = 561 nm/570-620 nm  比例尺：20 μm

使用流式细胞仪检测

通过流式细胞仪进行定量分析

——FerroOrange的荧光强度可能受细胞密度和细胞种类的影响

——培养基的更换和清洗可能使染料从细胞内泄露

——进行流式定量分析时，需优化实验步骤

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<Usage Example>
1. HeLa cells (1 x105 cells/well) in MEM (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin) were seeded on a 6 well plate and were cultured at 37oC in a 5% CO2 incubator overnight.
2. The cells were washed with serum-free medium (2 mL) three times. Then, serum-free medium (1 mL) was added to the cells.
3. 10 mmol/L Ammonium iron (II) sulfate (10 μL) was added to wells (The final concentration: 100 μmol/L).
4. To mix Ammonium iron(II) sulfate and serum-free medium, the entire medium was pipetted up from wells and then immediately pipetted back one time.
5. The cells were incubated for 20 min in a 37oC incubator equilibrated with 95% air and 5% CO2, and the cells were washed with HBSS (1 mL) three times.
6. After trypsinization (250 µL), stop the reaction with serum medium (1 mL), 1.25 ml of the cell suspension was transferred to a microcentrifuge tube.
7. The cells suspension was centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes.
8. The supernatant was discarded and HBSS (1 mL) was added to the microcentrifuge tube and suspended by pipetting.
9. The cells suspension was centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes and the supernatant was discarded.
10. 1 μmol/L FerroOrange in MEM (serum-free medium) (300 μL) was added to the cells.
11. The cells were incubated for 15 -30 min in a 37oC incubator equilibrated with 95% air and 5% CO2.
12. The stained cells were passed through a cell strainer and analyze samples using a flow cytometer.

<注意点>

1.清洗对于结果分析的影响

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2.染料体积对于结果分析的影响

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常见问题Q&A

Q1:FerroOrange由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？
A1:由于FerroOrange是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。
Q2: FerroOrange只会检测游离铁吗？还是某些如铁硫蛋白里的结合铁，都可以检测吗？
A2：FerroOrange只检测游离的二价铁
Q3: 有哪些帮助实验成功的技巧？
A3:（1）染色后不要清洗工作液，因为这样可能会让细胞内的FerroOrange泄露出来。

（2）为了获得更加可靠的实验数据，我们建议准备Bpy（2,2`联吡啶，抑铁剂）或硫酸亚铁铵（增铁剂）处理的细胞作为对照组，以便于FerroOrange的数据进行比较。
Q4: FerroOrange能否用于固定处理之后的样本?
A4:不能用于石蜡切片。

试剂能尝试于温和条件下固定处理之后的样本，如多聚甲醛（PFA，终浓度3%）在4°C中培养10 min。与未固定的样本相比，固定20 min以上或室温固定后的样本的荧光强度会明显降低。请注意本探针可能很难于固定样本中使用，必须先进行染色，然后做尝试。
Q5:本探针适合于什么检测方式？
A5:见表格

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我们建议使用绿色激光（Ex:532 nm）激发FerroOrange
Q6:染色时需要注意什么？
A6：注意如下，

1.FerroOrange染色后的对培养基的更换。

染色后无需清洗工作液，通常血清中含有铁离子，请注意使用不含血清的培养基，所以染色后即使细胞外有残留的FerroOrange，但是因为细胞外没有血清中铁离子的影响，也不会产生背景荧光的问题。

2.细胞难以染色(灵敏度低)时的办法。

根据细胞种类的不同，染色程度也有差异。

使FerroOrange working solution浓度高于推荐的1 µmol/l进行染色。建议在1-5 µmol/l范围内染色。
Q7:使用荧光酶标仪的操作步骤
A7：请参考下面的实验例子进行测量。

<测定样品>。

样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。

样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。

<测量操作>。

1.在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃  5%CO2 培养箱中过夜培养。

2.样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。

3.向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µmol/l)，在37℃  5%CO2培养箱中静置30分钟。

4.用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.向样品A和C中添加100 μl的1 µmol/l FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µmol/l)和Bpy(最终浓度:100 µmol/l)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。

6.用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

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Q8：推荐的滤光片
A8: 激发滤光片:530-565 nm

发射滤光片:570-620 nm
Q9: FerroOrange染色后是否有必要洗掉工作液？
A9:我们建议染色后不要清洗，因为这样可能会导致细胞中的FerroOrange泄露出来。

以下有关于不同细胞密度和细胞种类确认的情况，

<不同细胞密度>

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<不同细胞种类>

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参考文献

1.K. Tomita, M. Fukumoto, K. Itoh, Y. Kuwahara, K. Igarashi, T. Nagasawa, M. Suzuki, A. Kurimasa and T. Sato, “MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells.”, Biochem. Biophys Res Commun., 2019,DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117

2.Y. Wang and M. Tang, “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environ. Pollut., 2019, 264,DOI: 10.1016/j.envpol.2019.07.105

3.S Guo, X Yao, Q Jiang, K Wang, Y Zhang, H. Peng, J. Tang and W. Yang , “Dihydroartemisinin-Loaded Magnetic Nanoparticles for Enhanced Chemodynamic Therapy”, Front Pharmacol,2020,11,226.DOI: 10.3389/fphar.2020.00226

4.R. A. Weber, F. S. Yen, S.P.V. Nicholson, H. Alwaaseem, E.C. Bayraktar,M. Alam, R. C. Timson, K. La, M. Abu-Remaileh, H. Molina and K. Birsoy, “Maintaining Iron Homeostasis Is the Key Role of Lysosomal Acidity for Cell Proliferation”, Mol. Cell, 2020, 77, 1-11.DOI: 10.1016/j.molcel.2020.01.003

5.X. Li, T. Wang, X. Huang, Y. Li, T. Sun, S. Zang, K. Guan, Y. Xiong, J. Liu and H. Yuan , “Targeting ferroptosis alleviates methionine‐choline deficient (MCD)‐diet induced NASH by suppressing liver lipotoxicity”, Liver Int., 2020,DOI: 10.1111/liv.14428

6.T. Hirayama, M. Niwa, S. Hirosawa and H. Nagasawa, “High-Throughput Screening for the Discovery of Iron Homeostasis Modulators Using an Extremely Sensitive Fluorescent Probe”, ACS Sens., 2020,DOI: 10.1021/acssensors.0c01445

论文6中记载的 “RhoNox-4”的化合物就是“FerroOrange”。

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