活性氧检测试剂盒(ROS Assay Kit)货号:R252

活性氧检测试剂盒(ROS Assay Kit)货号:R252
活性氧检测试剂盒
ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-
商品信息
储存条件:0-5°C
运输条件:常温

特点:

● 比DCFH-DA更高的灵敏度

● 可多种仪器上机

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试剂盒内含
产品概述
荧光特性
技术信息
实验例
参考文献
常见问题Q&A

试剂盒内含

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产品概述

    ROS Reactive Oxygen Species 主要是在线粒体中合成 ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面, ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。

最近的研究发现,由二价铁所诱发的芬顿反应所引起的一种新的细胞死亡方式(铁死亡,Ferroptosis)的研究领域里 ROS也被广泛关注,检测 ROS的需求和意义也在不断升高 1)。目前在检测 ROS时,使用最多的试剂是DCFH-DA。但是 DCFH-DA往往有灵敏度低、样品荧光与背景的差别不明显等问题 。本试剂盒是一种高灵敏度的ROS检测试剂盒,而且配套使用本试剂盒内附带的 Buffer,可以在相对更低的细胞毒性下对 ROS进行高灵敏度检测。

荧光特性

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技术信息

与市面现有试剂的比较

活性氧反应的选择性

高灵敏度DCFH-DA与常规DCFH-DA对活性氧(ROS)的反应性相同。
另外,由于具有与DCFH-DA相同的荧光特性(λex:505nm,λem:525nm),因此能够以相同的激发/荧光波长进行检测。

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检测灵敏度的比较

用DCFH-DA和ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA-分别对过氧化氢(1×10 4细胞/ ml)处理的HeLa细胞进行染色,并比较细胞内ROS的荧光结果。结果显示,在任何检测仪器中,同仁化学ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA都以比DCFH-DA拥有更高的灵敏度。

(1)荧光显微镜检测

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<检测条件>
Ex.488 nm / Em.500 -560 nm
细胞种类:HeLa细胞

(2)使用荧光酶标仪检测

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<检测条件>
Ex.490-520 nm / Em.510-540 nm
细胞种类:HeLa细胞

(3)使用流式细胞仪检测

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<检测条件>
FITC激发电压:215 V
细胞种类:HeLa细胞

实验例

一.Erastin处理的A549细胞的内在性ROS的检测

1. 向 ibidi 8-well plate中接种A549细胞 (1××104 cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-37°C 、 5% CO2培养箱内过夜培养 。

2. 去除培养基,加入用 DMEM培养基 稀释好的 50 μμmol/l的 Erastin溶液, 37°C 、 5% CO2培养箱过夜培养 。

3. 去除上清,HBSS清洗 2次 ,加入 Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solution 37°C 、 5% CO2培养箱培养 30 min。

4. 去除Working solution HBSS清洗 2次 ,再次加入 HBSS,用荧光显微镜观察。

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二.LPS处理的巨噬细胞内源性ROS的检测

用LPS(脂多糖)处理的RAW264.7细胞中细胞内ROS的变化的荧光成像结果显示,LPS处理可增加细胞内ROS。

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<检测条件>
细胞内ROS(高灵敏度DCFH-DA染料):Ex. 488 nm / Em.500 -560 nm

<实验操作>
1.在ibidi 8孔板中接种RAW264.7细胞(3×104细胞,DMEM,10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素)
2.培养箱(37℃,5%)过夜培养
3.除去培养基,用HBSS洗涤细胞两次,然后添加用DMEM培养基稀释的500 ng / ml LPS
4.培养箱(37°C,5%CO2) 孵育20小时
5.除去上清液,用HBSS洗涤细胞两次,然后添加高灵敏度DCFH-DA染料工作液。
6.培养箱(37°C,5%CO2)培养30分钟
7.培养30分钟后除去工作溶,用HBSS洗涤细胞两次后再添加HBSS并用荧光显微镜观察。

三.柳氮磺吡啶(SSZ)引起的细胞内代谢变化

向A549细胞添加已知抑制胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(xCT)的柳氮磺吡啶(SSZ)之后,确认了细胞内的ROS、ATP、α-谷氨酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)的变化和谷氨酸释放量的变化。

结果显示,由于SSZ的添加,细胞内的ATP、谷胱甘肽(GSH)以及谷氨酸的释放量减少,细胞内的α-谷氨酸和ROS增加。

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参考文献

1)Shogo Okazaki et al., “Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”. Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

常见问题Q&A

Q1:   请告诉我一个试剂盒可以测多少个样品?
A1:可以测量的样品数量请参考以下内容。
・96-well plate:1块
・ibidi8-well   plate:6块
・35mm dish:5块
・6-well plate:5孔
Q2:有没有可以用作阳性对照的实验例?
A2:使用说明书上记载了经过过氧化氢处理的HeLa细胞的检测实验例。
Q3: Highly Sensitive DCFH-DA   working solution可以用Loading Buffer以外的溶液配置吗?
A3:为了减轻染色时对细胞的损伤,推荐使用附带的Loading   Buffer配置,Hanks’HEPES和HBSS也可以进行制备。如果用培养基进行制备时请使用无血清培养基。
Q4:染色后的清洗可以使用PBS代替HBSS吗?
A4:为了减轻对细胞的损伤推荐HBSS。如果手头没有HBSS的话,建议用培养基清洗。
Q5:用荧光显微镜检测时有什么注意事项吗?
A5:染料与ROS反应并氧化后发出荧光。如果激发光持续照射,则染料会被氧化,背景会上升,因此,在获取荧光成像图像时,请先调整明场环境下的焦点和参数,然后再获取荧光图像。

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