特点：
·日本原装进口试剂盒
·固定和不固定都可使用
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试剂盒内含
产品概述
DNA含量分析在流式细胞检测中，占有相当大的比例。通过这种方法，研究者可以进行抗癌药物的毒性评估，并对恶性肿瘤细胞的预后效果及进展程度进行分析。在细胞周期检测中，DNA含量也同样作为重要的分析手段而被广泛应用。通过细胞DNA含量的测定，可计算各细胞周期的百分率，也可通过DNA片段化检测、DNA双染标记等方法检测细胞凋亡。
Cell Cycle Assay Kit-PI/RNase Staining试剂盒，可快速完成细胞周期的分析，操作简便。本产品使用碘化丙啶 (PI) 作为DNA荧光染料，通过流式细胞术得到细胞周期中G0/G1，G2和S期细胞的比例。
所需的设备和材料
– 流式细胞仪（碘化丙啶PI:λex=535 nm，λem=617 nm）
– 37℃培养箱
– PBS缓冲液
– 1.5 ml微量管
– 100-1000 μl、20-200 μl、2-20 μl移液器
溶液制备
本产品在固定细胞及不细胞固定的情况下皆可使用。
配置Working solution (1 sample)
取500 μl Assay Buffer 后，分别加入25 μl PI Solution和2.5 μl RNase Solution。
＊工作液易遇光分解，请在使用前立即配置并用铝箔纸包裹避光保存。
配置好的工作液1天内用完。
基本操作
非固定细胞
1. 将细胞密度调整为1-5×106cells/ml a)。
2. 取1 ml的细胞悬液加入到1.5 ml微型管中，在1,000×g离心3 min b)。
3. 去除上清液后加入1 ml PBS缓冲液清洗细胞，在1,000×g离心3 min。
4. 去除上清液后加入0.5 ml Working Solution。
5. 在4℃避光培养30 min。
6. 涡旋振荡使细胞分散，在37℃避光培养30 min。
7. 涡旋振荡使细胞分散，用尼龙筛网过滤，以去除样品中的细胞团块 c)。
8. 用流式细胞仪检测。
a) 贴壁细胞用胰蛋白酶-EDTA消化细胞后，用PBS洗涤并离心收集细胞。
b) 根据不同的细胞种类，需适当调整转速与离心时间。
c) 样品处理后，剩余部分无法继续保存并使用。
固定细胞
1. 将细胞密度调整为1-5×106cells/ml a)。
2. 取1 ml的细胞悬液加入到1.5 ml微型管中，在1,000×g 离心3 min。
3. 去除上清，并在细胞团中加入1 ml的-20℃保存的70%乙醇。
4. 涡旋振荡使细胞分散，在4℃下静置2 h b)。
5. 在1,000×g 离心3 min后，去除乙醇 c)。
6. 加入1 ml PBS缓冲液清洗细胞，在1,000×g 离心3 min。
7. 去除上清液后加入0.5 ml Working Solution。
8. 涡旋振荡使细胞分散，在37℃避光培养30 min。
9. 涡旋振荡使细胞分散，在4℃避光培养30 min。
10. 涡旋振荡使细胞分散，用尼龙筛网过滤，以去除样品中的细胞团块 d)。
11. 用流式细胞仪检测。
a) 贴壁细胞用胰蛋白酶-EDTA消化细胞后，用PBS洗涤并离心收集细胞。
b) 根据不同的细胞种类，需适当调整固定时间。
c) 根据不同的细胞种类，需适当调整转速与离心时间。
d) 样品处理后可以在4℃以下保存并继续使用，但是保存时间长短与细胞种类有关。
常见问题Q&A
| Q1、C543用于分散细胞团聚的筛网的品牌、型号信息? |
| A1:FALCON 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap 型号：352235 |
| Q2:实验需要在37度、4度环境中分别培养30min，这个先后顺序对实验结果有影响吗? |
| A2：从做出的实验结果来看，没有影响。可以自由选择。 |
| Q3:流式管作用是什么? |
| A3:检测时必须将细胞悬液放入流式管中，流式管的最上方有滤膜，这层滤膜的作用是把细胞打散，使其不团聚，也方便流式仪器吸取细胞的时候更容易) |
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分子量：
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特点：
● 与死细胞DNA结合
● 常用于细胞凋亡检测
● 可与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用
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规格性状
规格
特性：该产品为红棕色粉末或固体，易溶于水和稀盐酸。
水溶性：试验成功
NMR光谱：试验成功
产品概述
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
荧光特性
λex=530 nm, λem=620 nm
操作说明
1.用PBS或适当的缓冲液制备10-50μMPI溶液。a）
2.在细胞培养基中加入体积为细胞培养基1/10的PI溶液。b）
3.将细胞在37oC下孵育10-20分钟。
4.用PBS或适当的缓冲液清洗细胞两次。
5.在带有535 nm激发光和615 nm发射滤光片的荧光显微镜下观察细胞。
a）由于PI可能致癌，因此在处理过程中必须格外小心。
b）或者您可以用1/10浓度的PI缓冲溶液代替培养基。
文献
1) I. W. Taylor and B. K. Milthorpe, “An Evaluation of DNA Fluochromes, Staining Techniques, and Analysis for Flow Cytometry. I. Unperturebed Cellpopulations”, J. Histochem. Cytochem., 1980, 28(11), 1224.
2) W. M. J. Vuist, F. V. Buitenen, M. A. De Rie, A. Hekman, P. Ruemke and C. J. M. Melief, “Potentiation by Interleukin 2 of Burkitt’s Lymphoma Therapy with Anti-Pan B (Anti-CD19) Monoclonal Antibodies in a Mouse Xenotransplantation Model”, Cancer Res., 1989, 49, 3783.
3) A. K. El-Naggar, J. G. Batsakis, K. Teague, L. Garnsey and B. Barlogie, “Single- and Double-stranded RNA Measurements by Flow Cytometry in Solid Neoplasms”, Cytometry, 1991, 12, 330.
4) C. Souchier, M. Ffrench, M. Benchaib, R. Catallo and P. A. Bryon, “Methods for Cell Proloferation Analysis by Fluorescent Image Cytometry”, Cytometry, 1995, 20, 203.
5) T. Irino, T. Kitoh, K. Koami, T. Kashima, K. Mukai, E. Takeuchi, T. Hongo, T. Nakahata, S. M. Schuster and M. Osaka, “Establishment of Real-Time Polymerase Chain Reaction Method for Quantitative Analysis of Asparagine Synthetase Expression”, Mol. Diagn., 2004, 6, 217.
常见问题Q&A
| Q1:核染色中所用染料的特征和区别是什么？
|
|
A1： 这里引入的染料具有通过与核酸相互作用而发出荧光或增加荧光强度的特性。 除荧光波长以外的差异如下。 [EB] 它没有碱基特异性，可与所有DNA和RNA结合。 它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。 [PI] 像EB一样，它没有基础特异性。它是一种更广泛使用的染料，因为插入时它的荧光强度比EB高。 它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。 [DAPI] 与双链小槽结合。它与腺嘌呤-胸苷簇具有高度结合。 它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。 [AO] 通过利用插入双链时和与单链磷酸结合时荧光波长不同的事实，可以在双链和单链之间进行区分。 它渗透到活细胞的细胞膜上。 [Hoechst33342，33258] 它与DNA的腺嘌呤胸苷部分特异性结合。 它是一种颜料，可以渗透到活细胞的细胞膜上并染色活细胞的DNA。
|
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Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。 |
| A2： |
| Q3:如何使用PI进行核染色？
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A3:一个例子如下所示。根据细胞类型和观察条件，考虑细胞固定和试剂浓度。 [使用示例①] Vollenweider等人进行了PI染色，并在荧光素激活的杀伤（LAK）细胞增殖试验中使用了荧光板读数器进行了测量。 此时的浓度为0.5 mg / mL PBS（-）。所用浓度为5μg/ mL柠檬酸钠溶液，每孔100μL用于荧光染色。 ·I.Vollenweider，P.Groscurth，J.Immunol.Methods，149，133（1992）。 [用法示例（2）] （1）对于包含实体瘤或团块的样品，请用0.02％tripsin EDTA处理。 在37°C下孵育30分钟后，以1500 rpm进行5分钟，然后弃去上清液。 （2）在-20℃用50％甲醇固定后，以1500rpm进行5分钟，并弃去上清液。 （3）在-20℃下用30％甲醇洗涤后，以1500rpm进行5分钟，弃去上清液。 （4）用0.2 mol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤后，以1500 rpm进行5分钟，并弃去上清液。 （5）每106个细胞RNase 0.2 mol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）溶液（1 mg / mL） 加入0.2 mL，并在37°C下孵育30分钟。 （6）用0.2 mol / L磷酸盐洗涤后，以1500 rpm进行5分钟，并弃去上清液。 （7）加入10 mL PI溶液（50μg/ mL），在黑暗中于4°C染色2小时。 ・医学院出版《流式细胞仪入门》 |