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DNA损伤丨从实验思路到检测指标  PDF下载

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Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

特点:3：与核仁相关的领域的报告示例

将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或

Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。

<染色条件>

细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。

将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

通过图像对核仁进行分析

用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。

横河电机CQ1拍摄条件

使用板：96孔板

物镜：40倍

激发波长：

405nm（DAPI）：蓝色

488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色

视野：16视野

<解析图像>

蓝框线：核

红框线：核仁

在传代数较多的细胞中，得到了一个细胞核中只有一个核仁的比例增加，而两个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)^*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)^*2得到了相同的结果。

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.

*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

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DNA损伤丨从实验思路到检测指标  PDF下载

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DNA的氧化损伤是由于DNA与活性氧 (ROS) 尤其是羟自由基之间的相互作用造成的。由超氧阴离子和过氧化氢通过Fenton反应产生的羟自由基在DNA中产生多重修饰。羟自由基对脱氧核糖基团的氧化攻击将导致DNA释放自由碱基，产生链断裂、各种糖修饰以及单个无碱基位点 (AP位点) 。事实上AP位点是由ROS产生的损伤的主要类型。醛反应性探针 (ARP；N’-氨氧基甲基羰基肼-D-生物素) 特异性地与AP位点的开环上的醛基反应。通过这个反应可以检测到导致醛基形成的DNA修饰。用过量ARP试剂反应后，DNA上的所有AP位点均用生物素做了标签。可以用亲和素-生物素法，用连接到亲和素上的过氧化物酶或碱性磷酸酶做比色法检测来对这些带有生物素标签的AP位点进行计数。DNA损伤定量试剂盒包含用于检测每1×10⁵个碱基对中1-40个AP位点的所有必需溶液。

＊本试剂盒仅适用于基因组DNA中无碱基位点 (Abasic Sites)的检测。

DNA损伤在除了复制过程中的DNA聚合酶错误外，保留有机体遗传信息的DNA在体内还受到环境辐射，紫外线，化学物质（如烷基化剂）和代谢物（如活性氧）的破坏，接收。如果这些错误和伤害得不到适当的修复，它们将导致突变，从而导致癌症和衰老。

DNA损伤部位有修复结构，其中之一就是去除碱修复。此时，将出现一个称为AP位点的基础位点（apurinic/apyrimidinic位点）。换句话说，AP位点的检测是可以测量DNA损伤位点的有效方法。

ARP（N’-氨基氧基甲基羰基肼基-D-生物素）是已知可以与该AP位点进行生物素特异结合的试剂。-Nucleostain-DNA Damage Quantification Kit-AP Site Counting-是一种可以通过使用ARP将DNA生物素化并固定在96孔微板上，可以简单地定量样品DNA中的AP 位点的试剂盒。

该试剂盒包含具有与AP位点的标准DNA，并且可以使用HRP标记的链霉亲和素通过生物素检测方法对AP位点进行定量。

使用方法请看实验例。

*冷藏保存中或恢复到室温时，有时会在管状管中看到水滴状的液粒。

这是由干燥防止剂液粒化而成的，产品的性能没有问题。

＊本套装中含有加入了溶液的试剂组件。

溶液可能会粘附在试管或瓶盖的内壁上，因此在打开前应先摇匀

除试剂盒以外必要的物品

・10μl，200μl，1 ml微量移液器（可变型）

・200μl多通道移液器（可变型）

・培养箱（37℃）

・酶标仪

・0.5 ml，1.5 ml离心管

・离心机

・DNA纯化试剂盒

・纸巾

本公司出售各种DNA纯化试剂盒。

Get pureDNA Kit-Cell, Tissue(Code：GK03)

关于DNA提纯的问题，请咨询同仁化学。

1) A. Sancar and G. B. Sancar, “DNA Repair Enzymes”, Annu. Rev. Biochem., 1988, 57, 29.

2) T. Lindahl and B. Nyberg, “Rate of Depurination of Native Deoxyribonucleic Acid”, Biochemistry, 1972, 11, 3610.

3) M. Liuzzi and M. Talpaert-Borle, “A New Approach to the Study of the Base-excision Repair Pathway Using Methoxyamine”, J. Biol. Chem., 1985, 260, 5252.

4) M. Weinfeld, M. Liuzzi and M. C. Paterson, “Response of Phage T4 Polynucleotide Kinase Toward Dinucleotides Containing Apurinic Sites: Design of a 32P-postlabeling Assay for Apurinic Sites in DNA”, Biochemistry, 1990, 29, 1737.

5) B. X. Chen, K. Kubo, H. Ide, B. F. Erlanger, S. S. Wallace and Y. W. Kow, “Properties of a Monoclonal Antibody for the Detection of Abasic Sites, a Common DNA Lesion”, Mutat. Res., 1992, 273, 253.

6) J. A. Gralnick and D. M. Downs, “The YggX Protein of Salmonella enterica Is Involoved in Fe(II) Trafficking and Minimizes the DNA Damage Cause by Hydroxyl Radicals:Residue CYS-7 is Essential for YggX Function”, J. Biol. Chem., 2003, 278, 20708.

7) J. W. Pippin, R. Durvasula, A. Petermann, K. Hiromura, W. G. Couser and S. J. Shankland, “DNA Damage is a Novel Response to Sublytic Complement C5b-9 Induced Injury in Podocytes”, J. Clin. Invest., 2003, 111, 877.

8) S. Watanabe, T. Ichimura, N. Fujita, S. Tsuruzono, I. Ohki, M. Shirakawa, M. Kawasuji and M. Nakao, “Methylated DNA-binding Domain 1 and Methylpurine DNA Glycosylase Link Transcriptional Repression and DNA Repair in Chromatin”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 12859.

9) M. Endres, M. Ahmadi, I. Kruman, D. Biniszkiewicz, A. Meisel and K. Gertz, “Folate Deficiency Increases Postischemic Brain Injury”, Stroke, 2005, 36, 321.

10) J.-M. Li, M. Mogi, K. Tsukuda, H. Tomochika, J. Iwanami, L.-J. Min, C. Nahmias, M. Iwai and M. Horiuchi, “Angiotensin II-Induced Neural Differentiation via Angiotensin II Type 2 (AT2) Receptor-MMS2 Cascade Involving Interaction between AT2 Receptor-Interacting Protein and Src Homology 2 Domain-Containing Protein-Tyrosine Phosphatase 1”, Mol. Endocrinolo., 2007, 21(2):499.

11) D. R. McNeill and D. M. Wilson III, “A Dominant-Negative Form of the Major Human Abasic Endonuclease Enhances Cellular Sensitivity to Laboratory and Clinical DNA-Damaging Agents”, Mol. Cancer Res., 2007, 5(1), 61.