自噬

自噬

通过自身降解的途径,从而将一些没有用的杂质变废为宝成为营养物质。在饥饿或者化学刺激的情况下,在细胞质中首先会形成隔离膜,待降解的物质逐渐包裹其中,最终形成自噬体。随后溶酶体的外膜会与溶酶体外膜相融合,此时溶酶体中的酸性水解酶发挥作用,开始降解之前自噬体内含物,从而达到自噬目的。动态观察整个自噬流对于反映细胞内的自噬活性举足轻重。
线粒体自噬
细胞自噬
品名 货号 用途
线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit MD01 线粒体自噬检测试剂盒
Mtphagy Dye试剂 MT02 线粒体自噬

线粒体自噬试剂盒原理:

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇:Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

1606369445891830.png

细胞自噬流程图:

image.png

自噬试剂原理:

image.png

DAPGreen和DALGreen在头部具有末端氨基功能的化学结构(该结构如磷脂酰乙醇胺)该结构的一部分嵌入在疏水膜环境中。

image.png

自噬隔离膜在形成中被DALGreen和DAPGreen处理的共聚焦显微镜图像 比例尺:20 μm

image.png

当自噬体膜形成时,DAPGreen嵌入膜内。嵌入的DAPGreen是一种pH不敏感探针,在亲脂性条件下,其荧光增强。

image.png

当自噬体的膜形成时,DALGreen同样会嵌入膜内,DALGreen是一种pH敏感探针,在酸性条件下,自噬体与溶酶体结合后荧光增强。

实验例:

1.DALGreen与LC3的高度相关性

image.png

用1 μmol/l的DALGreen染色后,用无氨基酸培养基分别培养HeLa细胞0、2、4、6h。

用20 μm/l抗LC3抗体和抗肌动蛋白抗体检测的LC3 I-和LC3 II的相对表达水平并用免疫印迹分析法验证其相对表达水平。

结果证明DALGreen荧光强度的增加与LC3-I, LC3-lI转化率相关。

2.自噬细胞的荧光成像

image.png

用1 μmol/l DALGreen染色后,并用野生型和ULK 1/ULK2 DKO的MEF细胞分别进行处理(或不处理)

并添加雷帕霉素和氯喹8小时后。在ULK1/ULK2双敲除(DKO)MEF细胞中几乎没有观察到DALGreen荧光信号,

对酵母的同源功能有缺陷Atg1蛋白,即使存在氯喹(COL)。DALGreen荧光信号也正确反映了自噬的发生。

3.对自噬细胞抑制处理后的荧光成像

image.png

在3-Methyladenine(3-MA)存在的情况下,饥饿HeLa细胞的DALGreen荧光值降低。

样品:5小时饥饿的HeLa细胞,DALGreen:1 μmol/l,3-MA:5 mmol/l,比例尺:20 μm

4.DAPGreen和tagRFP-LC3共染

image.png

DAPGreen荧光信号与tagRFP-LC3信号有高度相关性,且DAPGreen和tagRFP-LC3都可以染色活细胞。

样本:tagRFP-LC3表达MEF细胞。DAPGreen: 0.1 μmol/l,比例尺:10 μm

5.DAPGreen和Lamp1-tagRFP共染色

image.png

从溶酶体中可观察到大量DAPGreen荧光信号并看到DAPGreen与Lamp 1-tagRFP

(溶酶体染色探针)存在共定位关系。因为DAPGreen不仅染色自噬体,而且也染色自噬溶酶体。

样本:Lampl-tagRFP表达的MEF细胞  DAPGreen: 0.1 μmol/l,比例尺:10 μm

6.DALGreen和tagRFP-LC3共染

image.png

几乎所有的DALGreen荧光信号都与LC3存在共定位关系。tagRFP-LC3

不仅染色自噬体也染色自溶酶体,而DALGreen的荧光信号表示细胞中有自噬溶酶体的存在

样本: tagRFP-LC3表达MEF细胞  DALGreen:1 μmol/l,比例尺:10 μm

7.DALGreen和Lamp1-tagRFP共染

image.png

几乎所有的DALGreen都与Lamp1-tagRFP共定位。Lamp-tagRFP染色溶酶体,

而DALGreen的荧光信号表示细胞中有自噬溶酶体的存在

样本:Lamp1-tagRFP表达的MEF细胞,DALGreen:1 μmol/l,比例尺:10 μm

发表评论