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Quin 2试剂货号：Q001 CAS号：73630-23-6

发表于由
Quin 2试剂货号：Q001
8-Amino-2-[(2-amino-5-methylphenoxy)methyl]-6-methoxyquinoline-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetrapotassium salt
CAS号：73630-23-6
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：

 C26H23K4N3O10

分子量：

693.87

特点：

 

● 激发波长339nm，发射波长492nm

● 能够轻易的穿过细胞膜

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选择规格：
50 mg
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钙离子检测方案
产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
溶解比例
注意事项
文献
Q&A

产品性状

规格

性状 ：                      本产品为淡黄色粉末，可溶于水

纯度（HPLC）:          95%以上

摩尔吸光系数 ：        34,000 以上(240 nm附近)

水溶性：                     符合要求

处理条件

保存方法 ：                避光，常温

产品概述

Quin 2能够和钙（logKCaY=7.1）形成稳定的荧光螯合物，但和镁却不行（logMgY=2.7）。这种螯合物在525 nm的发射波长处有着很高的量子产量（0.14），Quin 2的激发波长为339 nm，发射波长为492 nm。Quin 2-AM是Quin 2的乙酰甲酯衍生物，能够轻易地穿过细胞膜。进入细胞后，酯结构立刻被水解，形成Quin 2。

原理

Quin 2能够和钙（logKCaY=7.1）形成稳定的荧光螯合物，但和镁却不行（logMgY=2.7）。这种螯合物在525 nm的发射波长处有着很高的量子产量（0.14），Quin 2的激发波长为339 nm，发射波长为492 nm。Quin 2-AM是Quin 2的乙酰甲酯衍生物，能够轻易地穿过细胞膜。进入细胞后，酯结构立刻被水解，形成Quin 2。

激发发射波长

E x ：339 nm

Em： 492 nm

溶解比例

溶解比例：84 mg/100 mL（水）

注意事项

1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

3、溶解液 DMSO 需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完建议分装保存，例如分装成 5 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件

文献

1) R. Y. Tsien, “New Calcium Indicators and Buffers with High Selectivity against Magnesium and Protons:　Design, Synthesis, and Properties of Prototype Structures”, Biochemistry, 1980, 19 (11), 2396.

2) R. Y. Tsien, T. Pozzan and T. J. Rink, “Calcium Homeostasis in Intact Lymphocytes: Cytoplasmic Free Calcium Monitored with a New, Intracellularly Trapped Fluorescent Indicator”, J. Cell Biol., 1982, 94, 325.

3) M. B. Feinstein, J. J. Egan, R. I. Sha’afi and J. White, “The Cytoplasmic Concentration of Free Calcium Inplatelets Is Controlled by Stimulators of Cyclic AMP Production (PGD2, PGE1, FORSKOLIN)”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 113, 598.

4) N. Miyoshi, K. Hara, S. Kimura, K. Nakanishi and M. Fukuda, “A New Method of Determining Intracellular Free Ca2+ Concentration Using Quin　2-fluorescence”, Photochem. Photobiol., 1991, 53 (3), 415.

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么，选择什么样的比较好呢？
 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择，产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂，其特点如下：

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射：λem=500 nm

•解离常数：224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发：λex=508 nm、发射：λem=527 nm

•解离常数：400 nmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发：λex=495 nm、发射：λem=518 nm

•解离常数：360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发：λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数：250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片，可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•（需要两台检测仪器）

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发：λex=553 nm、发射：λem=576 nm

•解离常数：1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发：λex=339 nm、发射：λem=492 nm

•解离常数：110 nmol/L

•最早开发的产品

SulfoBiotics- Sodium tetrasulfide (Na2S4)货号：SB04 CAS号：12034-39-8

发表于由
-SulfoBiotics- Sodium tetrasulfide (Na2S4)货号：SB04
Sodium disulfide, anhydrous
CAS号：12034-39-8
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储存条件：4度
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分子量：

174.22

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100mg*5
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多硫供体
规格性状
产品概述
生物体内存在含硫烷硫分子的种类
Sodium polysulfide的构造
参考文献

规格性状

规格：100 mg× 5

 

性状： 本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

 

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

1643423223792767.png

※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

 

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

参考文献

1) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka, and H. Kimura, “Polysulfides are possible H2S-derived signaling molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
2) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura, and K. Ishii, “Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity caused by t-buthylhydroperoxide through Nrf2 signaling in neuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 3548.
3) E. R. DeLeon, Y. Gao, E. Huang, M. Arif, N. Arora, A. Divietro, S. Patel, and K. R. Olson , “A case of mistaken identity: are reactive oxygen species actually reactive sulfide species?”, American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology ., 2015, 310, (7), 549.
4) D. Delgermuruna, S. Yamaguchia, O. Ichiib, Y. Konb, S. Itoa, and K. Otsuguroa, “Hydrogen sulfide activates TRPA1 and releases 5-HT from epithelioid cells of the chicken thoracic aorta”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology., 2016, 187, 43 .
5) S. Koikea, T. Kayamaa, S. Yamamotoa, D. Kominea, R. Tanakaa, S. Nishimotoa, T. Suzukia, A. Kishidab, and Y. Ogasawaraa, “Polysulfides protect SH-SY5Y cells from methylglyoxal-induced toxicity by suppressing protein carbonylation: A possible physiological scavenger for carbonyl stress in the brain”, NeuroToxicology., 2016,55, 13 .

SulfoBiotics- Sodium trisulfide (Na2S3)货号：SB03 CAS号：37488-76-9

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-SulfoBiotics- Sodium trisulfide (Na2S3)货号：SB03
Sodium trisulfide, anhydrous
CAS号：37488-76-9
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分子量：

142.16

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多硫供体
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产品概述
生物体内存在含硫烷硫分子的种类
Sodium polysulfide的构造
参考文献

规格性状

规格：100 mg× 5

 

性状： 本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

 

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

1643422937194794.png

※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

 

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

 

参考文献

1) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka, and H. Kimura, “Polysulfides are possible H2S-derived signaling molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
2) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura, and K. Ishii, “Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity caused by t-buthylhydroperoxide through Nrf2 signaling in neuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 3548.
3) E. R. DeLeon, Y. Gao, E. Huang, M. Arif, N. Arora, A. Divietro, S. Patel, and K. R. Olson , “A case of mistaken identity: are reactive oxygen species actually reactive sulfide species?”, American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology ., 2015, 310, (7), 549.
4) D. Delgermuruna, S. Yamaguchia, O. Ichiib, Y. Konb, S. Itoa, and K. Otsuguroa, “Hydrogen sulfide activates TRPA1 and releases 5-HT from epithelioid cells of the chicken thoracic aorta”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology., 2016, 187, 43 .
5) S. Koikea, T. Kayamaa, S. Yamamotoa, D. Kominea, R. Tanakaa, S. Nishimotoa, T. Suzukia, A. Kishidab, and Y. Ogasawaraa, “Polysulfides protect SH-SY5Y cells from methylglyoxal-induced toxicity by suppressing protein carbonylation: A possible physiological scavenger for carbonyl stress in the brain”, NeuroToxicology., 2016,55, 13 .

-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)货号：SB02 CAS号：22868-13-9

发表于由
-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)货号：SB02
Sodium disulfide, anhydrous
CAS号：22868-13-9
商品信息
储存条件：4度
运输条件：常温运输

分子量：

110.11

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SDS
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100mg*5
现货 
 
硫化氢检测
规格性状
产品概述
生物体内存在含硫烷硫分子的种类
Sodium polysulfide的构造
参考文献

规格性状

规格：100 mg× 5

 

性状： 本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

 

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

1643422049622935.png

※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体 Sodium disulfide(Na2S) Sodium trisukfide(Na2S3) Sodium tetrasulfide(Na2S4)
构造 Na+-S-S–Na+ Na+-S-S-S-Na+ Na+-S-S-S–Na+
PKa1 5 4.2 3.8
pKa2 9.7 7.5 6.3
货号 SB02 SB03 SB04

 

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

参考文献

1) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka, and H. Kimura, “Polysulfides are possible H2S-derived signaling molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
2) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura, and K. Ishii, “Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity caused by t-buthylhydroperoxide through Nrf2 signaling in neuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 3548.
3) E. R. DeLeon, Y. Gao, E. Huang, M. Arif, N. Arora, A. Divietro, S. Patel, and K. R. Olson , “A case of mistaken identity: are reactive oxygen species actually reactive sulfide species?”, American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology ., 2015, 310, (7), 549.
4) D. Delgermuruna, S. Yamaguchia, O. Ichiib, Y. Konb, S. Itoa, and K. Otsuguroa, “Hydrogen sulfide activates TRPA1 and releases 5-HT from epithelioid cells of the chicken thoracic aorta”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology., 2016, 187, 43 .
5) S. Koikea, T. Kayamaa, S. Yamamotoa, D. Kominea, R. Tanakaa, S. Nishimotoa, T. Suzukia, A. Kishidab, and Y. Ogasawaraa, “Polysulfides protect SH-SY5Y cells from methylglyoxal-induced toxicity by suppressing protein carbonylation: A possible physiological scavenger for carbonyl stress in the brain”, NeuroToxicology., 2016,55, 13 .

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15 CAS号：1392113-30-2

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SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15
Bis(2,5,6-trimethylpyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione-3-ylmethyl)sulfide
CAS号：1392113-30-2
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：

C20H22N4O4S

分子量：

414.48

特点：

 

● HPLC的方法检测H2S

● 灵敏度高

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10 nmol*5
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硫化氢
产品性状
产品概述
检测原理
实验案例
文献

产品性状

规格

性状：                          本品为无色或淡黄色固体

纯度（HPLC）：           97%以上

含量               ：           0.540~0.600（370nm）

处理条件

保存方法：                   避光冷藏

产品概述

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H2S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H2S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane.采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane， 由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高1),2),3)。

检测原理

硫化氢 (H2S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H2S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H2S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane 。采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane， 由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高。

SB15 结构式 .jpg

实验案例

HPLC实验例

样品的预处理

1. 吸取30 ul样品至含有70 ul 100 mmol/l Tris-HCl缓冲液 (pH 9.5,0.1 mmol/l DTPA) 的管子中。

2. 加入50 ul 10 mmol/l的mBBr乙腈溶液。

3. 培养30 min。

4. 加入50 ul 200 mmol/l的 5-磺基水杨酸。

5. 取上清液作为检测样品。

* 有关mBBr法的详细情况，请参见Methods Enzymol.，2015，554，314)。

硫化氢的定量分析

6. 加入100 ul乙腈至含有10 nmol Sulfide dibimane的管子中，用移液器吹打使溶解，制成0.1 mmol/l 的Sulfide dibimane储存液。

7. 用乙腈稀释0.1 mmol/l Sulfide dibimane储存液，稀释成一个系列浓度梯度的溶液。

8. 吸取上述系列浓度梯度的溶液各5 ul注射入HPLC色谱柱，制成一条标准曲线 (下图)。

9. 通过HPLC分析样品 ，计算Sulfide dibimane的峰面积。

10. 用标准曲线计算样品中HS–的浓度。

注意：Sulfide dibimane溶液对光敏感，请避光并在一天内用完。

＜HPLC条件＞

柱：Inersil ODS-3

流动相：A) 0.1% TFA/H2O ，

B) 0.1% TFA/Acetonitrile (TFA: Trifluoroacetic acid) B conc.：

5%-35% (0-5 min)，

35%-55% (5-16 min)，

55%-70% (16-23 min)

检测：荧光 (Ex: 390 nm, Em: 475 nm)

流速：1 ml/min

柱温：40℃

SB15 标准曲线.jpg

文献

1) G. L. Newton, R. Dorian and R. C. Fahey,Anal. Biochem., 1981, 114, 383.

2) E. A. Wintner, T. L. Deckwerth, W. Langston, A.Bengtsson, D. Leviten, P. Hill, M. A. Insko, R.Dumpit,E.Vanden Ekart, C. F. Toombs and C. Szabo,Br. J. Pharmacology, 2010, 160, 941.

3) X. Shen, C. B. Pattillo, S. Pardue, S. C. Bir, R.Wang and C. G. Kevil,Free Radic. Biol. Med., 2011, 50, 1021

 

关联产品

Biotin-PEAC5-maleimide试剂货号：B299 CAS号：374592-98-0

发表于由
Biotin-PEAC5-maleimide试剂货号：B299
N-6-(Biotinylamino)hexanoyl-N’-[2-(N-maleimido)ethyl]piperazine, hydrochloride
CAS号：374592-98-0
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：室温
分子式：

C26H41ClN6O5S

分子量：

585.16

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选择规格：
10mg
期货
 
蛋白抗体标记检测方案
试剂盒内含
规格性状
产品概述
原理
操作步骤
参考文献

试剂盒内含

1622191643665758.jpg

规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：90.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2基）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH基）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

当在用氨基标记蛋白质时不能使用有机溶剂时，可以使用具有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的链霉亲和素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

1606961245315403.png

操作步骤

产品使用步骤:

1. 制备含巯基的抗体

1) 用PBS溶解DTT (浓度为200mmol/l)，制成DTT溶液。

2) 精确称量1.0-5.0mg抗体并记录，加入500ul 10mmol/l HEPES Buffer (pH8.0) 溶解蛋白质，制成抗体溶液。

3) 在抗体溶液加入2ul DTT溶液，充分混合。

2. 凝胶过滤纯化

1) 打开NAP-5层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的抗体溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一根管子，在层析柱中加入1mlPBS，收集流出的抗体。

3. 生物素标记

1) 用DMSO溶解Biotin-PE-maleimide (浓度为50mmol/l，4.7mg/200ul或10mg/424ul)。

＊用Biotin-PEAC5-maleimide时浓度为5.9mg/200ul或10mg/342ul。

2) 在纯化好的抗体溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，抗体：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:10左右。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25℃)中过夜培养。

4. 标记抗体的凝胶过滤纯化

1) 打开NAP-10层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约15ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取1ml标记好的抗体溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一根管子，在层析柱中加入1.5ml PBS，收集流出的生物素标记抗体。

参考文献

1) S. Hashida, M. Imagawa, S. Inoue, K. H. Ruan and E. Ishikawa , “Mor Useful Maleimide Compounds for the Conjugation of Fab’ to Horseradish Peroxidase throuth Thiol Groups in the Hinge”, J. Appl. Biochem., 1984, 6, 56.

2) E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Toshitake, Y. Hamaguchi and T. Ueno, “Enzyme-labeling of Antibodies and their Fragments for Enzyme Immunoassay and Immunohistochemical Staining”, J. Immunoassay, 1983, 4, 209.

3) H. -J. Friesen, P. Hermentin and P. Gronski, “Novel Maleimido-Biotins for the Selective Biotinylation of Sulfhydrils”, Protides Biol. Fluids, 1987, 34, 43.

4) E. Ishikawa, S. Hashida, T. Kohno, T. Kotani and S. Ohtani, “Modification of Monoclonal Antibodies with Enzymes, Biotin, and Fluorochromes and Their Applications”, Immunol. Ser., 1987, 33, 113.

5) R. B. del Rosalio and R. L. Wahl, “Disulfide Bond-targeted Radiolabeling : Tumor Specificity of a Streptavidine-biotinylated Monoclonal Antibody Complex”, Cancer Res. (Suppl.), 1990, 50, 804S.

Biotin-Osu试剂货号：B304 Biotin N-Succinimidyl D-biotin CAS号：35013-72-0

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Biotin-Osu试剂货号：B304
Biotin N-Succinimidyl D-biotin
CAS号：35013-72-0
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C14H19N3O5S

分子量：

341.38

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蛋白抗体标记检测方案
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产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

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规格性状

性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。

纯度（HPLC）：95.0％以上

二甲基亚砜可溶：测试合格

产品概述

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。

间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。

如果有机溶剂不能用于蛋白质的氨基标记，则可以使用带有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。

用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。

在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的抗生蛋白链菌素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。

原理

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操作步骤

产品使用步骤:

  1. 参照下表配制50mmol/l的生物素标记试剂溶液：

    1606964947767725.png

由于生物素标记试剂遇水易分解，所以需要现配现用。

2. 蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

3. 标记蛋白质的凝胶过滤及纯化。

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

常见问题Q&A

 

Q1:氨基标记有两种类型，OSu和Sulfo-OSu。 它们有何不同？
 

A:反应性几乎相同。由于磺基-OSu型具有磺酸基，因此它在水中的溶解度很高，并且可以在高浓度下反应。当您不想向系统中添加有机溶剂（例如DMSO）时，它也很有效。另一方面，在储存过程中它容易吸收水分并容易水解。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。

参考文献

1) P. Kongtawelert and P. Ghosh, ” A New Sandwich-ELISA Method for the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids Employing a Monoclonal Antibody and Labelled Avidin Biotin Technique.”, Clin. Chem. Acta,, 1990, 195, 17.

2) G. Paganelli, S. Pervez, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassllati and A. A. Epenetos, “Intraperitoneal Radio-localization of Tumors Pre-targeted by Biotinylated Monoclonal Antibodies”, Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.

3) C. Wagener, U. Kruger and J. E. Shively, “Selective Precipitation of Biotin-labeled Antigens or Monoclonal Antibodies by Avidin for Determining Epitope Specificities and Affinities in Solution-phase Assays”, Methods Enzymol., 1990, 184, 518.

4) D. M. Boorsma, J. Van Bommel and E. M. Vander Raaij-Helmer, “Simultaneous Immunoenzyme Double Labelling Using Two Different Enzymes Linked Directly to Monoclonal Antibodies or with Biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.

5) A. Komura, T. Tokuhisa, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone and Y. Mishima, “Specific Killing of Human Melanoma Cells with an Efficient 10B-compound on Monoclonal Antibodies”, Pigment Cell Res., 1989, 2, 259.

6) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli and P. Neri, “Competitive Enzyme Immunoassay for Human Chorionic Somatomammotropin Using the Avidin-biotin System”, Anal. Biochem., 1981, 118, 168.