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Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测 L248 细胞脂质过氧化物检测

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Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测 L248 细胞脂质过氧化物检测

氧化应激与自由基

氧是合成激素和ATP等生物活性物质的一种重要的分子。获得利用氧的能力是生命进化的重要的驱动力。氧可以激活细胞中的各种酶，被激活的氧种类涉及细胞功能的运作。尽管氧本身是生命的一个基本元素，但在氧化应激中，诸如DNA和蛋白质等细胞中的分子有时会被活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 破坏。
抗氧化能力
活性氧
谷胱甘肽
DNA损伤
脂质过氧化物
铁离子
谷氨酰胺、谷氨酸
自由基
NO研究

品名货号用途

Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测 L248 细胞脂质过氧化物检测
MitoPeDPP试剂 M466 线粒体内脂质过氧化物检测

细胞中的氧化应激是由代谢、电离辐射和与DNA直接相互作用的致癌化合物产生的ROS导致的。在代谢的过程中，小部分的氧由于一个电子的还原变成超氧阴离子，接着超氧阴离子被超氧化物岐化酶 (SOD) 转变成氧气和过氧化氢。过氧化氢由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶还原成水。然而如果过氧化氢并没有被这些酶完全还原，当它被铁(Fenton反应)氧化将产生反应性极强的羟自由基。羟自由基还可以由紫外线照射产生或直接电离辐射水产生。羟自由基可以与脂反应产生脂质过氧化物。然而并非所有ROS都是有害的。次氯酸盐离子是一种由中性粒细胞的髓过氧化物酶产生的过氧化氢衍生而来的ROS，它具有杀菌活性。NO也称为内皮来源的舒张因子，它是由NO合成酶产生的。不过NO和超氧阴离子反应可产生具有细胞毒性的过氧亚硝基阴离子。ROS和活性氮化合物在生物系统中具有许多不同的活性。相应地好氧生物会产生防止氧化应激的防御机制。最近在对防御机制以及氧化损伤与疾病或老化过程之间关系的研究中，氧化应激已成为许多研究的焦点。最终已发展出许多用于检测ROS相关或ROS来源的物质的方法，这些物质包括超氧阴离子、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、DNA损伤、8-氧基鸟嘌呤、8-硝基鸟嘌呤和蛋白质羰基等。

Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测货号：L248

发表于由
Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测货号：L248
细胞脂质过氧化物检测试剂盒
Liperfluo
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光，充氮气
运输条件：室温

分子式：

C51H41N2O8P

分子量：

840.85

特点：

● 特异性检测铁死亡相关的脂质过氧化

● 比BODIPY C11更适合于胞内定位

● 铁死亡常见指标之一

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研究领域
原理
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操作步骤
实验例
常见问题Q&A
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规格性状

性状：深红色结晶粉末或固体。

纯度（HPLC）：90.0%以上

核磁共振谱：符合一致性

<使用次数>每50µg可用5-50次

产品概述

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

特点：

1）能够成像和检测细胞中的脂质过氧化物

2）长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响

3）高度脂质过氧化物特异性

研究领域

在铁死亡研究中：

作为细胞死亡形式之一，在铁死亡研究中使用到Liperfluo

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    细胞种类

(铁死亡诱导剂）

                                   论文信息
人支气管上皮细胞（RSL3） Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium.
小鼠成纤维细胞(RSL3) Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis.
HeLa细胞

(添Erastin或Brefeldin A)

 Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells.

原理

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

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荧光特性

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激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm

操作步骤

1.在培养皿或孔板中接种细胞。

2.去除上清液，用无血清培养基洗涤细胞1次。

3.加入适量的Liperfluo工作溶液，37℃孵育30 m in。

*根据实验条件等不同因素，Liperfluo的最佳浓度也不同。需要提前摸索条件。

4.去除上清液并用无血清培养基洗涤细胞2次。

5.在荧光显微镜下观察细胞或使用流式细胞仪分析细胞。

实验例

用激光共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

 

1) 在 -slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种H eLa细胞 (3.0×10 4 个/孔、含10% 胎牛血清M EM 培养基)，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清M EM 培养基清洗细胞1次。

3) 将200 l用无血清M EM 培养基稀释的1 m ol/l的Liperfluo 溶液加入8孔板中，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中培养30 m in。

4) 去除溶液，用200 l H BSS清洗2次。

5) 均匀地加入200 l用H BSS稀释的500 m ol/l的 t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中培养60 m in。

6) 用共聚焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm ，发射波长：500-550 nm )。

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用流式细胞仪检测HeLa细胞

 

1) 将H eLa细胞 (1.0×10 5 个/孔、含10% 胎牛血清M EM 培养基) 接种至6孔板 (Therm o公司) 中，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清M EM 培养基清洗细胞1次。

3) 将2 m l用无血清M EM 培养基稀释的1 m ol/l的Liperfluo溶液加入6孔板中，在37℃ 5% 的

C O 2 培养箱中培养30 m in。

4) 去除溶液，用2 m l H BSS清洗2次。

5) 均匀地加入2 m l用H BSS稀释的500 m ol/l的t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中培养60 m in。

6) 用胰酶消化细胞后，用含有血清的M EM 培养基重悬细胞，移至管中并将培养基更换为H BSS。

7) 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm ，发射波长：500-550 nm )。

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用Erastin诱导铁死亡细胞的荧光成像

 

1) 在 -slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×10 5 个/孔、含10% 胎牛血清D M EM 培养基)，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，加入200 l用无血清D M EM 培养基稀释的50 m ol/l的Erastin溶液，

在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中过夜培养。

3) 去除培养基，用200 l H BSS清洗2次。

4) 去除H BSS，加入200 l用H BSS稀释的5 m ol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5% 的C O 2 培养箱中

培养30 m in。

5) 去除溶液，用200 l H BSS清洗2次。

6) 用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm ，发射波长：500-550 nm )。

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常见问题Q&A

Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针， 哪种方法比较好？
A1: 都可以。

先加Liperfluo再加药

用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

（1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×104个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。

（3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

（6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

先加药再加Liperfluo

（1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

（4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。
Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？
A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。

其他的改善方法：

(1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。

(2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。
Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？
A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。
Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？
A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。     此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。

(溶解后请务必用铝箔等遮光)。

荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。

因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。

1.增强激发光的强度。

2.延长曝光时间。
Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞
A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。

有实验经验的：HL-60细胞(悬浮细胞)，CHO细胞·SH-SY5Y细胞(贴壁细胞)等，固定的细胞不能染色。

 

参考文献

以下文献根据影响因子由高到低排序：

 

细胞种类 期刊名 出版年 影响因子 论文题目(含原文链接)
小鼠胚胎成纤维细胞 Nature 2023 69.5 Phase separation of FSP1 promotes ferroptosis
H9C2（大鼠心肌细胞） Nature 2022 69.504 A   non-canonical vitamin K cycle is a potent ferroptosis suppressor
B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞);   HT-1080(人纤维肉瘤细胞) Nature 2019 69.504 CD8+ T cells regulate tumour     ferroptosis during cancer immunotherapy
MEF(小鼠胚胎成纤维细胞) Nature   Chemical   Biology 2016 12.587 Oxidized arachidonic and adrenic   PEs navigate cells to   ferroptosis
RAW 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞) Nature   Chemical   Biology 2020 12.587 Redox lipid reprogramming   commands   susceptibility of macrophages and microglia to ferroptotic   death
Brain slices   from LN229TAZ(4SA)(人脑胶质瘤切片) Nature   Communications 2020 12.121 Neutrophil-induced     ferroptosis promotes tumor necrosis in glioblastoma progression
HBE(人支气管上皮样细胞) The   Journal of   Clinical Investigation 2018 11.864 Pseudomonas aeruginosa utilizes host   polyunsaturated   phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis   in bronchial   epithelium
HL-60(人骨髓细胞白血病细胞) Cell   Death and   Differentiation 2020 10.717 Oxygenated   phosphatidylethanolamine   navigates phagocytosis of ferroptotic cells   by interacting with TLR2
NCI-ADR/Res   (NAR) 人卵巢腺癌细胞 Biomaterials 2019 10.317 Triggered     ferroptotic polymer micelles for reversing multidrug resistance to     chemotherapy
4T1细胞(小鼠乳癌细胞) ACS   Applied Materials   & Interfaces 2019 8.758 Boosting the Ferroptotic   Antitumor Efficacy via   Site-Specific Amplification of Tailored Lipid   Peroxidation
BV2   Microglial(小鼠小胶质细胞) Particle   and Fibre   Toxicology 2020 7.546 Induction of ferroptosis in   response to   graphene quantum dots through mitochondrial oxidative   stress in microglia
BMDM(小鼠骨髓来源的巨噬细胞) Particle   and Fibre   Toxicology 2017 7.546 SiO2 and   TiO2 nanoparticles synergistically trigger macrophage inflammatory     responses
HT-22（细胞） Antioxidants 2023 7.0 Hypoxia Aggravates Neuron Ferroptosis in Early Brain Injury Following Subarachnoid Hemorrhage via NCOA4-Meditated Ferritinophagy
3T3-L1   adipocytes(小鼠脂肪细胞) Cell   Death and   Disease 2018 6.304 Osteocalcin triggers     Fas/FasL-mediated necroptosis in adipocytes via activation of p300
OEC-M1(人口腔上皮细胞) Biomaterials     Science 2018 6.183 Assessment of zero-valent   iron-based nanotherapeutics for   ferroptosis induction and   resensitization strategy in cancer cells
Hacat(人永生化角质形成细胞) Free   Radical Biology   and Medicine 2017 6.17 Blue light-induced     oxidative stress in live skin
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞) Free   Radical Biology   and Medicine 2015 6.17 New aspects of     24(S)-hydroxycholesterol in modulating neuronal cell death
HEI-OC1(耳蜗毛细胞);鼠新生耳蜗毛细胞 Oxidative   Medicine   and Cellular Longevity 2020 5.076 Liproxstatin-1 Protects Hair   Cell-Like HEI-OC1 Cells and   Cochlear Hair Cells against Neomycin   Ototoxicity
 Murine T cells(鼠T细胞) The   Journal of   Immunology 2019 4.886 Murine T Cell Maturation   Entails   Protection from MBL2, but Complement Proteins Do Not Drive   Clearance of Cells   That Fail Maturation in the Absence of NKAP
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞) Molecular     Neurobiology 2020 4.5 Activation of   p62-Keap1-Nrf2 Pathway   Protects 6-Hydroxydopamine-Induced Ferroptosis   in Dopaminergic Cells
HEI-OC1(耳蜗毛细胞) Journal   of Cellular   and Molecular Medicine 2020 4.486 Inhibition of ferroptosis protects   House Ear   Institute-Organ of Corti 1 cells and cochlear hair cells   from   cisplatin-induced ototoxicity
PMVECs(肺微血管内皮细胞) Lung   Cellular and   Molecular Physiology 2019 4.406 Genetic inactivation of the     phospholipase A2 activity of peroxiredoxin 6 in mice protects against     LPS-induced acute lung injury
HepG2(人肝癌细胞) Journal   of   Agricultural and Food Chemistry 2019 4.192 Novel Fluorescence-Based   Method To   Characterize the Antioxidative Effects of Food Metabolites   on Lipid Droplets   in Cultured Hepatocytes
HeLa(人宫颈癌细胞) Communications     Biology 2018 4.165 Golgi stress mediates redox   imbalance   and ferroptosis in human cells
THP-1(人髓系白血病单核细胞);(1×105 cells/mL) Scientific   Reports 2016 3.998 Molecular hydrogen regulates gene   expression by modifying   the free radical chain reactiondependent   generation of oxidized phospholipid   mediators
4T1细胞(小鼠乳癌细胞); HT1080(人纤维肉瘤细胞) Nanotechnology 2016 3.551 WO3/Pt   nanoparticles   promote light-induced lipid peroxidation and lysosomal   instability within   tumor cells
SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞) RSC   Advances 2012 3.119 A novel fluorescent probe with high   sensitivity and   selective detection of lipid hydroperoxides in cells
Burkitt’s   Lymphoma(Burkitt淋巴瘤细胞) Biochemical   and   Biophysical Research Communications 2019 2.985 Artesunate activates the     ATF4-CHOP-CHAC1 pathway and affects ferroptosis in Burkitt’s Lymphoma
THP-1(人髓系白血病单核细胞) Canadian   Journal of   Physiology and Pharmacology 2019 1.946 Molecular hydrogen suppresses   free radical-induced cell   death by mitigating fatty acid peroxidation   and mitochondrial dysfunction
Horse breed   stallions(种马精子) Animal   Reproduction   Science 2019 1.66 Effects of media and     promoters on different lipid peroxidation assays in stallion sperm
Human hair(人头发) Cosmetics 2018 0.732 Mechanism of Cuticle Hole   Development   in Human Hair Due to UV-Radiation Exposure

 

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铁死亡 脂质过氧化 铁离子

发表于由

铁死亡

铁死亡是一种主要由铁依赖的氧化损伤所引起的调节性细胞坏死。但这种死亡方式在形态学、生物化学和遗传学等方面与凋亡、坏死、自噬都有较大的差别。 下表为铁死亡常用检测指标，各指标检测方法可点击链接查看，其与铁死亡的关系可下拉，获取铁死亡特刊了解。
脂质过氧化
铁离子
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铁死亡的发生

在细胞中有大量的脂质组成细胞膜，细胞膜上的脂质会以大量磷脂的形式存在，细胞内的脂质会分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，在氧分子和铁离子的存在下，多不饱和脂肪酸的增加容易被氧化而产生脂质过氧化物，有更多的不饱和脂肪酸的情况下，会更容易扩散，引起细胞膜损伤，也就是我们说的铁死亡。但是正常的细胞是可以调控这种细胞膜损伤，也就是我们常说的GPX4通路等等抗氧化系统，所以细胞才能在氧化物质存在的情况下，仍然可以存活。

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以上为铁死亡的简要发生原理，我们也整理了较为详尽的铁死亡通路图，点击下方链接可直接下载

 铁死亡通路图下载链接

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如何检测铁死亡发生

    

各指标与铁死亡的关联性、检测注意事项等，请扫描以下二维码获取铁死亡特刊以及铁死亡讲座回放

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更多铁死亡指标，请点击查看本页上方表格内各指标详情↑

铁死亡的机制及其在疾病中的作用

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各种疾病与铁死亡的文献整理，请上拉扫描二维码联系我们获取

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实验例：Erastin诱导铁死亡发生

Erastin是一种已知的铁死亡诱导剂。通过抑制胱氨酸转运蛋白（xCT），erastin抑制胱氨碱的摄取。胱氨酸是谷胱甘肽的原料。因此，Erastin最终会降低GSH的含量。GSH的降低会导致脂质过氧化物的积累和铁死亡的诱导。

以下实验实例显示了在Erastin刺激下各指标结果的变化情况，各项指标均使用Dojindo试剂进行测量。

使用Erastin处理的A549细胞，我们测量了细胞内Fe2+、ROS、脂质过氧化物、谷胱甘肽、谷氨酸释放到细胞外含量和胱氨酸摄取。结果，观察到Erastin对xCT的抑制，导致谷氨酸的释放和胱氨酸的摄取也减少。此外，Erastin处理后，细胞内谷胱甘肽降低，细胞内Fe2+、ROS和脂质过氧化物增加。

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Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测货号：L248

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规格性状

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纯度（HPLC）：90.0%以上

核磁共振谱：符合一致性

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产品概述

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

特点：

1）能够成像和检测细胞中的脂质过氧化物

2）长波长激发，可以减少光损伤和自发荧光对细胞的影响

3）高度脂质过氧化物特异性

研究领域

在铁死亡研究中：

作为细胞死亡形式之一，在铁死亡研究中使用到Liperfluo

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        细胞种类

（铁死亡诱导剂）

                                                                     论文信息
人支气管上皮细胞（RSL3） Pseudomonas   aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger   theft-ferroptosis in bronchial epithelium.
小鼠成纤维细胞(RSL3) Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis.
HeLa细胞(添Erastin或Brefeldin A) Golgi stress   mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells.

原理

Liperfluo是Spy-LHP的类似物，可用于检测脂质过氧化物 (LPO)，Liperfluo会被脂质过氧化物特异性氧化而在乙醇等有机溶剂中发出很强的荧光。由于氧化型Liperfluo的激发和发射波长分别为524 nm和535 nm (均为长波长)，因此可以减轻光对测定样品的损伤和降低样品的自发荧光。由于Liperfluo在二异喹啉环的一个末端连接有四乙二醇基团，因此提高了它在水溶液中的分子分散性。虽然它的氧化型在水溶液中几乎没有荧光，但是在细胞膜等脂溶性高的部位会产生较强的荧光。因此Liperfluo适用于活细胞中脂质过氧化物的荧光成像或流式分析。

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荧光特性

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激发波长Ex：488 nm，发射波长Em：500-550 nm

操作步骤

1.在dish等容器中接种细胞并培养。

2.去除培养基后，用无血清培养基清洗一次。

3.加入合适浓度的Liperfluo工作液，在37℃培养30 min。

※请根据细胞种类，诱导药物等实验条件，摸索最佳的Liperfluo工作液浓度。

4.去除上清液后，用无血清培养基清洗2次。

5.用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

实验例

用激光共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种HeLa细胞 (3.0×104个/孔、含血清MEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将200 μl用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的 t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

6) 用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

1606290396601275.png

用流式细胞仪检测HeLa细胞

1) 将HeLa细胞 (1.0×105个/孔、含血清MEM培养基) 接种至6孔板(Thermo公司) 中，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞1次。

3) 将2 ml用无血清MEM培养基稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入6孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

4) 去除溶液，用2 ml HBSS清洗2次。

5) 均匀地加入2 ml用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP (tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

6) 用胰酶消化细胞后，用含有血清的MEM培养基重悬细胞，移至管中并将培养基更换为HBSS。

7) 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。

image.png

用Erastin诱导铁死亡细胞的荧光成像

1) 在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

2) 去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

3) 去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

4) 去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

5) 去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

6) 用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

image.png

常见问题Q&A

Q1.文献实验方法：先加Liperfluo，后加药；说明书实验方法：先加药，后加探针， 哪种方法比较好？
A1: 都可以。

先加Liperfluo再加药

用共聚焦荧光显微镜观察HeLa细胞

（1）在μ-slide 8孔板中（ibidi公司）接种HeLa细胞（3.0×104个/孔、含血清MEM培养基），在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，用无血清MEM培养基清洗细胞一次。

（3）将200 μl无血清MEM培养基稀释后的1 μmol/l的Liperfluo溶液加入8孔板中，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（4）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（5）均匀地加入200 μl用HBSS稀释的500 μmol/l的t-BHP(tert-Buthyl Hydroperoxide) 溶液，在37℃ 5%的CO2培养箱中培养60 min。

（6）用共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。

先加药再加Liperfluo

（1）在 μ-slide 8孔板中 (ibidi公司) 接种A549细胞 (1.0×105个/孔、含血清DMEM培养基)，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（2）去除培养基，加入200 μl用无血清DMEM培养基稀释的50 μmol/l的Erastin溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中过夜培养。

（3）去除培养基，用200 μl HBSS清洗2次。

（4）去除HBSS，加入200 μl用HBSS稀释的1 μmol/l的Liperfluo溶液，

在37℃ 5%的CO2培养箱中培养30 min。

（5）去除溶液，用200 μl HBSS清洗2次。

（6）用激光共焦荧光显微镜观察 (激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm)。
Q2. Liperfluo如果按照文献进行，先加探针，后加药，荧光淬灭时间为2小时可能无法满足实验，希望延长荧光时间，是否有好的方法？或者是否可以加荧光防淬灭剂？
A2: 关于荧光抗淬灭剂：由于抗淬灭剂的作用原理，有可能无法在实验中使用。

其他的改善方法：

(1)如果褪色的原因是由光源照射造成的褪色。可以尝试减小光源强度进行观测。

(2)清洗操作后长时间放置可能会造成探针向细胞外漏出。可考虑不清洗直接观察。
Q3.Liperfluo由于是活细胞荧光探针，如果铁死亡发生，导致细胞膜破裂后，荧光是否存在？
A3:由于Liperfluo是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。
Q4：培养基中酚红或血清对实验有没有影响？此外，在背景高或荧光弱的情况下有没有改善意见？
A4:可用于酚红或含血清培养基。但是，如果背景高，请用PBS替换。     此外，当背景较高时，Liperfluo可能会被光自然氧化，培养时也请尽量遮光。

(溶解后请务必用铝箔等遮光)。

荧光强度弱的情况下，即使反应时间延长，背景也会变高，所以不推荐。

因此，建议调整设备 (荧光观察)的条件。

1.增强激发光的强度。

2.延长曝光时间。
Q5：悬浮和贴壁细胞都可以使用Liperfluo染色吗？是否可以染色固定细胞
A5:悬浮和贴壁细胞，都可以使用。

有实验经验的：HL-60细胞(悬浮细胞)，CHO细胞·SH-SY5Y细胞(贴壁细胞)等，固定的细胞不能染色。

参考文献

细胞种类 诱导剂 抑制剂 Liperfluo终浓度和培养时间 检测仪器 期刊名 出版年 影响因子 论文题目(含原文链接) 开放获取
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GPX4 Antibody——GPX4抗体货号：GPX4

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硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的主要调节剂，铁死亡是铁依赖性脂质过氧化诱导的程序性细胞死亡的一种形式（1,2）。GPX4 将脂质氢过氧化物转化为无毒脂质醇，从而防止了铁锈病（2）。研究表明，硒可增强 GPX4 表达并抑制铁传染性死亡以保护神经元（3）。另外，某些抗治疗性癌细胞依靠 GPX4 存活。GPX4 的丢失会导致铁死亡，从而防止小鼠肿瘤复发（4）。此外，由 GPX4 介导的氧化还原稳态对于激活胞质 DNA 感应 cGAS-STING 通路和随后的先天免疫应答（5）的启动是必不可少的。

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4.Hangauer, M.J. et al. (2017) Nature 551, 247-50.

5.Jia, M. et al. (2020) Nat Immunol 21, 727-35.

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