特点：
● 特异性外泌体定位，细胞外不聚集
● 回收率高
● 多种颜色可供选择
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试剂盒内含
概述
近年来研究发现，外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非常重要，然而目前广泛使用的磷脂双分子层的荧光染料存在明显的缺点（1. 染色后外泌体粒径增大。2. 荧光染料自身形成粒子，造成背景增高）。本产品是为了解决这些问题而开发的新型荧光染料，并且有 Green, Red, Deep Red 三种颜色，可满足多重染色在内的各种实验需求。
技术情报
更准确地观察外泌体的动态
常用于染色外泌体的膜染色染料(S公司 产品P)，染料本身会引起凝集，产生不来源于外泌体的荧光聚点，导致外泌体的性质变化和背景上升等问题1)2)。
ExoSparkler系列中使用的染料(Mem Dye-Green，Red，Deep Red)不会引起荧光凝集，也几乎不影响外泌体的性质，因此可以更准确地观察外来体的动力学。
参考文献
1) Mehdi Dehghani et al.,“Exosome labeling by lipophilic dye PKH26 results in significant increase in vesicle size”.bioRxiv., 2019, doi:10.1101/532028.
2) Pužar Dominkuš P et al.,“PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.”Biochim Biophys Acta Biomembr., 2018, doi: 10.1016/j.bbamem.2018.03.013.
特点
特点1:荧光染料不会在细胞外聚集
将使用Mem Dye-Deep Red和使用产品P(绿色或红色)染色的外泌体添加到HeLa细胞中，并用荧光显微镜观察进入细胞内的外泌体。
结果，在用产品P(绿色或红色)染色的外泌体中，发现了疑似染料聚集的细胞外荧光亮点。
Mem Dye-Deep Red(紫)：Ex： 640 nm/ Em： 640-760 nm
S公司 P产品(绿)：Ex： 561 nm/ Em： 560-620 nm
S公司 P产品(红)：Ex： 640 nm/ Em： 650-700 nm
实验条件
通过超速离心法提取的外泌体(蛋白质量为10 µg)，使用不同荧光染料染色后，添加到HeLa细胞(1.25×104cells)中，孵育24小时，观察清洗后的荧光图像。
通过NTA (Nanoparticle Tacking Analysis)技术检测发现，Dojindo的Mem Dye-Deep Red没有荧光聚集现象，而P产品（绿色或红色）发现了可疑的100-500 nm粒径的粒子。
*检测装置：LM10-HSBFT 14（Nanosight公司生产）
与Mem-Dye溶液相比，P产品溶液的粒径也发生变化
另外，Mem Dye-Green, Red和Mem Dye-Deep Red一样，也没有发现荧光聚集的现象。
特点2：对外泌体的性质几乎没有影响
比较使用Mem Dye-Deep Red和使用产品P（绿色或红色）染色前后的外泌体，通过测定NTA（纳米粒子跟踪分析）和zeta电位以确认外泌体的性质是否变化。
结果，确认使用产品P（绿色或红色）会因染色而引起的外泌体的变化。
而Mem-Dye系列（Green、Red、Deep Red）对外泌体的性质几乎没有影响。
对外泌体颗粒直径的影响
制备Mem-Dye系列(Green、Red、Deep Red)以及产品P(绿色、红色)的10 µmol/l DMSO溶液，对10 µg(蛋白质量)的外泌体进行染色后进行了NTA(纳米粒子跟踪分析)。
结果，用Mem-Dye系列染色的外泌体与未染色的外泌体，粒子数以及粒子直径几乎没有影响(下图左)，但在产品P染色前后，粒子数和粒子直径有明显的变化(下图右)。
＊检测装置：LM10-HSBFT 14 (Nanosight公司生产)
对外泌体膜电位的影响
制备Mem-Dye系列(Green、Red、Deep Red)以及产品P(绿色、红色)的10 µmol/l DMSO溶液，并对10 µg(蛋白质含量)的外泌体进行染色后测定Zeta电位。
结果证实，使用Mem-Dye系列染色与使用产品P染色比较，使用Mem-Dye引起的Zeta电位变化会小很多
＊检测装置：Zetasizer Nano ZSP(Malvern Panalytical公司生产)
参考文献
Takashi Shimomura et al., “New Lipophilic Fluorescent Dyes for Exosome Labeling: Monitoring of Cellular Uptake of Exosomes”.bioRxiv., 2020, doi:10.1101/2020.02.02.931295.
特点3：外泌体的标记和纯化一步到位
ExoSparkler系列已经对外泌体标记的最佳条件进行摸索并做成了操作手册，试剂盒内包含纯化所需的过滤管，可以简单快捷的进行外泌体的标记和纯化。
纯化方法(未反应染料的去除)的比较
ExoSparklar系列中用于除去未反应染料的过滤管，与以往使用的相同用途的凝胶过滤法相比，能够以更高的回收率纯化外泌体。
| 回收率 | |||||
| 过滤管（本试剂盒） | 50% | ||||
| 凝胶过滤法 | 10% | ||||
| ※本公司的实施例：通过NTA技术（纳米颗粒跟踪分析）比较提取前后的外泌体粒子数 | |||||
关于使用过滤管进行纯化的有效性，常见问题是：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？详见Q&A。
特点4：多种颜色选择
ExoSparkler系列包括膜 (Mem Dye)和蛋白质 (Protein Dye)荧光染色试剂，各三种颜色 (Green, Red, Deep Red)。
■实验条件
超速离心法纯化的外泌体(蛋白质的量为10 μg)经过各试剂染色后，与HeLa细胞(1.25×104 cells)一起培养24 h，清洗后进行荧光观察。
■观察条件
Green: Ex： 488 nm / Em： 490-540 nm
Red: Ex： 561 nm / Em： 570-640 nm
Deep Red: Ex： 640 nm / Em： 640-760 nm
| 产品名称 | 容量 | 货号 | |||
| 外泌体膜荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green | 5 samples | EX01 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red | 5 samples | EX02 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX03 | |||
| 外泌体蛋白荧光染色试剂盒 | |||||
| （绿色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green | 5 samples | EX04 | |||
| （红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red | 5 samples | EX05 | |||
| （深红色）ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red | 5 samples | EX06 | |||
| *纯化的外泌体(超离心法)，蛋白质：1-10 µg/sample，粒子数：10-100×10^8个/sample | |||||
常见问题Q&A
| Q1：纯化外泌体建议用什么方法？ |
| A1：一般我们推荐使用超速离心法纯化外泌体。但是，免疫沉淀法和磁珠法纯化的外泌体也有过成功染色的实例。 目前，聚合物沉淀法纯化的外泌体由于有聚合物的残留会影响外泌体的染色，所以无法使用本试剂盒。 |
| Q2：细胞摄取外泌体时使用的是哪种培养基？ |
| A2：我们公司在做染色后外泌体进入细胞的实验时，使用过MEM（Minimum Essential Medium）和DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）。目前我们公司一直采用的含血清培养基进行外泌体实验，暂时无法推荐无血清培养基。 |
| Q3：染色后的外泌体可以长期保存吗？ |
| A3：染色后的外泌体不建议长期保存。染色后的外泌体最好尽快进行后续实验。 |
| Q4：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？ |
| A5:虽然在过滤膜上可以观察到颜色的残留，但是我们公司通过下面的实验验证了过滤膜上的回收产物里不含未反应的染料。 <实验条件> 超速离心法纯化的①含有外泌体（蛋白质含量10 µg）的缓冲液和②单纯缓冲液，分别按照试剂盒说明书记载的步骤进行染色操作。染色后的产物加入到HeLa细胞中（1.25×104 cells），4小时后进行荧光观察。 结果显示，单纯缓冲液染色后的回收产物加入到细胞后，没有观察到荧光，进而可证明回收产物中没有残留的染料。 |
① Exosome + Buffer
② Only Buffer
Fluorescent images at 4 h incubation
Detection conditions
Green：Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm
Red ：Ex 561 nm / Em 570 – 640 nm
Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm
参考文献
1) R.Kawata, S.Oda, Y. Koya, H.Kajiyama, T. Yokoi, “Macrophage-derived extracellular vesicles regulate concanavalin A-induced hepatitis by suppressing macrophage cytokine production”, Toxicology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.tox.2020.152544.
2）Misato Horie, Kurara Takagane , Go Itoh , Sei Kuriyama , Kazuyoshi Yanagihara , Masakazu Yashiro , Michinobu Umakoshi , Akiteru Goto , Junichi Arita and Masamitsu Tanaka，“Exosomes secreted by ST3GAL5high cancer cells promote peritoneal dissemination by establishing a premetastatic microenvironment”molecular oncology.，2023，doi:10.1002/1878-0261.13524.
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