C21H11NO5S
389.38
关联产品
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实验工具稀释计算器摩尔浓度计算器
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
NH2-reactive HiLyte FluorTM 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。
* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 647放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM647中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive HiLyte FluorTM647在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
| 1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto, J.C.R. Jones and D. Tsuruta, “Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization via a macropinocytic pathway”, Am. J. Pathol.., 2013, 182, (3), 828. |
| 2) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y. Baba, M. Ohta, “Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products”, J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323. |
| 3) Y. Hayashi, M. Okutani, S. Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, “Generation of anti-porcine CD69 monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of cellular immunity by flow cytometric analysis”, Anim. Sci. J.., 2018, 89, (5), 825. |
| 4) T. Kojima, J. Hata, H. Oka, K. Hayashi, K. Hitomi and H. Nakano, “Spatial arrangement of proteins using scCro-tag: application for an in situ enzymatic microbead assay.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018, 82, (11), 1911. |
| 5) S. Mawaribuchi, Y. Haramoto, H. Tateno, Y. Onuma, Y. Aiki and Y. Ito, “rBC2LCN lectin as a potential probe of early-stage HER2-positive breast carcinoma.”, FEBS Open Bio., 2020, DOI: 10.1002/2211-5463.12852. |
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备红色荧光标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和示踪用胞内蛋白。用NH2-reactive HiLyte FluorTM 555是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 555最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子与4-6个HiLyte FluorTM 555分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 555加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 555能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 555标记后的IgG的激发和发射波长分别为555nm和570nm。
* HiLyte FluorTM 为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 555-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 555放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。 b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 555中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive HiLyte FluorTM 555在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
| 1)A. Nagao, K. Sato, K.M. Nishida, H. Siomi, M.C. Siomi, “Gender-specific hierarchy in nuage localization of PIWI-interacting RNA factors in Drosophila”, Front Genet.,2011, 2, 55. |
| 2) H. Hoshino, G. Shioi, S. Aizawa, “AVE protein expression and visceral endoderm cell behavior during anterior–posterior axis formation in mouse embryos: Asymmetry in OTX2 and DKK1 expression”, Dev. Biol.., 2015, 402, (2), 175. |
| 3) T. Kaneko, T. Minohara, S. Shima, K. Yoshida, A. Fukuda, N. Iwamori, T. Inai and H. Iida, “A membrane protein, TMCO5A, has a close relationship with manchette microtubules in rat spermatids during spermiogenesis”, Mol. Reprod. Dev.., 2019, 86, (3), 330. |
| 4) Y. Nakashima, T. Mima, M. Yashiro, T. Sonou, M. Ohya, A. Masumoto, S. Yamanaka, D. Koreeda, K. Tatsuta, Y. Hanba, M. Moribata, S. Negi, T. Shigematsu, “Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) 23 and Klotho in the spleen: its physiological and functional implications”, Growth Factors ., 2016, 34, (5-6), 196. |
| 5) Z. Zhang, K. Kakutani, K. Maeno, T. Takada, T. Yurube, M. Doita, M. Kurosaka and K. Nishida, “Expression of silent mating type information regulator 2 homolog 1 and its role in human intervertebral disc cell homeostasis”, Arthritis Res. Ther.., 2011, 13, (6), R200. |
| 6) I. Hasan, M. Gerdol, Y. Fujii and Y. Ozeki, “Functional Characterization of OXYL, A SghC1qDC LacNAc-specific Lectin from The Crinoid Feather Star Anneissia Japonica.”, Mar Drugs., 2019, 17, DOI:10.3390/md17020136. |
| 7)Y. Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa, S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H. Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y. Ozeki, “A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP kinases.”, FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154. |
特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
活动进行中
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NO.1. Biotin Labeling Kit – NH2 生物素抗体标记试剂盒-氨基
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NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.4. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.5. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备用荧光素标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和胞内蛋白示踪。氨基反应型荧光素是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，包括Storage buffer。每一管荧光素最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个荧光素分子共价结合。该试剂盒还包含一个缓冲液交换系统，因此含有氨基缓冲液的样品也能用此试剂盒来标记。虽然用膜来过滤有时会导致IgG聚集，但是试剂盒中的缓冲液交换系统能够防止标记过程中聚集现象的发生。用该试剂盒标记的抗体在4℃下能够保存至少2个月。被荧光素标记后的IgG的激发和发射波长分别为495nm和520nm。
原理
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Fluorescein -IgG标记物始终存在于Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive fluorescein放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
a) 样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5 min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Fluorescein Dye在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解，如果没有DMSO的话，可以用乙醇来替代。
d) 如果IgG的量为200μg，在步骤4时加入所有的NH2-Reactive Fluorescein Dye溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
标记率计算
计算标记率：
1分子蛋白质上结合的荧光素的数量 (标记率) 的计算方法：将标记的蛋白质溶液用5倍的中性缓冲液稀释，分别测定在280nm和各个荧光染料的最大吸收波长处的吸光度，采用以下公式计算。
* 如果是IgG，摩尔吸光系数ε=216,000。
* 荧光染料在WS缓冲液中的摩尔吸光系数参见下表：
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10mg/ml或者70μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10μl 样品溶液和90μl Reaction Buffer以及8μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10μg。IgG的量在10μg-100μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
| 1) M. Hiyoshi, S. Suzu, Y. Yoshidomi, R. Hassan, H. Harada, N. Sakashita, H. Akari, K. Motoyoshi and S. Okada, “Interaction between Hck and HIV-1 Nef Negatively Regulates Cell Surface Expression of M-CSF Receptor”, Blood, 2008, 111(1), 243. |
| 2) W. Aung, A. Tsuji, H. Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga, “Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model”, Molecular Imaging, 2016, 15, 1. |
| 3) A. Shinya, K. Yamamoto, M. Kurata, S. Abe-Suzuki, R. Horii, F. Akiyama and M. Kitagawa, “Targeting MCM2 function as a novel strategy for the treatment of highly malignant breast tumors”, Oncotarget., 2015, 6, (33), 34892. |
| 4) K.M. Nishida, T.N. Okada, T. Kawamura, T. Mituyama, Y. Kawamura, S. Inagaki, H. Huang, D. Chen, T. Kodama, H. Siomi and M.C. Siomi, “Functional involvement of Tudor and dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines”, EMBO J.., 2009, 28, (24), 3820. |
| 5) P.G. Sreekumar, R. Kannan, M. Kitamura, C. Spee, E. Barron, S.J. Ryan and D.R. Hinton, “αB crystallin is apically secreted within exosomes by polarized human retinal pigment epithelium and provides neuroprotection to adjacent cells”, PLoS ONE., 2010, 5, (10), e12578. |
| 6) R. Asano, T. Kumagai, K. Nagai, S. Taki, I. Shimomura, K. Arai, H. Ogata, M. Okada, F. Hayasaka, H. Sanada, T. Nakanishi, T. Karvonen, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T. Kudo, M. Umetsu and I. Kumagai, “Domain order of a bispecific diabody dramatically enhances its antitumor activity beyond structural format conversion: the case of the hEx3 diabody”, Protein Eng. Des. Sel.., 2013, 26, (5), 359. |
| 7) R. Asano, I. Shimomura, S. Konno, A. Ito, Y. Masakari, R. Orimo, S. Taki, K. Arai, H. Ogata, M. Okada, S. Furumoto, M. Onitsuka, T. Omasa, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T. Kudo, M. Umetsu and I. Kumagai, “Rearranging the domain order of a diabody-based IgG-like bispecific antibody enhances its antitumor activity and improves its degradation resistance and pharmacokinetics”, MAbs., 2014, 6, (5), 1243. |
| 8) R. Asano, K. Ikoma, I. Shimomura, S. Taki, T. Nakanishi, M. Umetsu and I. Kumagai, “Cytotoxic enhancement of a bispecific diabody by format conversion to tandem single-chain variable fragment (taFv): the case of the hEx3 diabody”, J. Biol. Chem.., 2011, 286, (3), 1812. |
| 9) T. Toyotome, M. Yamaguchi, A. Iwasaki, A. Watanabe, H. Taguchi, L. Qin, H. Watanabe and K. Kamei, “Fetuin A, a serum component, promotes growth and biofilm formation by Aspergillus fumigatus”, Int. J. Med. Microbiol.., 2012, 302, (2), 108. |
| 10) W. Ma, V. Schubert, M. M. Martis, G. Hause, Z. Liu, Y. Shen, U. Conrad, W. Shi, U. Scholz, S. Taudien, Z. Cheng and A. Houben, “The distribution of α-kleisin during meiosis in the holocentromeric plant Luzula elegans”, Chromosome Res.., 2016, 24, (3), 393. |
| 11) Y. Yokoi, K. Nakamura, T. Yoneda, M. Kikuchi, R. Sugimoto, Y. Shimizu and T. Ayabe, “Paneth cell granule dynamics on secretory responses to bacterial stimuli in enteroids”, Sci. Rep.., 2019, 9, 2710. |
| 12) Y.J. Lee, S.R. Han, N.Y. Kim, S.H. Lee, J.S. Jeong and S.W. Lee, “An RNA aptamer that binds carcinoembryonic antigen inhibits hepatic metastasis of colon cancer cells in mice”, Gastroenterology., 2012, 143, (1), 155. |
| 13) C. F.O.Hoya, K. Kushiro, Y. Yamaoka, A. Ryo and M. Takai, ‘Rapid multiplex microfiber-based immunoassay for anti-MERS-CoV antibody detection’, Sens Biosensing Res., 2019,10.1016/j.sbsr.2019.100304. |
| 14) H. Takeuchi, N Sasaki, S. Yamaga, M. Kuboniwa, M. Matsusaki and A. Amano, “Porphyromonas gingivalis induces penetration of lipopolysaccharide and peptidoglycan through the gingival epithelium via degradation of junctional adhesion molecule 1”, PLoS Pathog., 2019, 15, (11), e1008124. |
| 15) Y. Yanase, Y. Matsuo, T. Kawaguchi, K. Ishii, A. Tanaka , K. Iwamoto , S. Takahagi and M.Hide, “Activation of Human Peripheral Basophils in Response to High IgE Antibody Concentrations without Antigens”., Int J Mol Med Sci, 2019, 20, (1), 45. |
| 16) M. Yashiro, M. Ohya, T. Mima, Y. Nakashima, K. Kawakami, T. Sonou, K. Tatsuta, Y. Yamano, S. Negi and T. Shigematsu, “Excessive ADAM17 activation occurs in uremic patients and may contribute to their immunocompromised status.”, Immun Inflamm Dis., 2020, 10.1002/iid3.298. |
| 17) H Fujishiro, H Yamamoto, N Otera, N Oka, M Jinno and S. Himeno, “In vitro Evaluation of The Effects of Cadmium on Endocytic Uptakes of Proteins into Cultured Proximal Tubule Epithelial Cells.”, Toxics, 2020, 8,10.3390/toxics8020024 |
| 18) Y. Liu, Y. Liu, X. Zheng, L. Zhao and X. Zhang, “Recapitulating and Deciphering Tumor Microenvironment by Using 3D Printed Plastic Brick–Like Microfluidic Cell Patterning”, Adv Healthc Mater, 2020, 9, (6), 1901713. |
特点：
● 可高灵敏的检测细胞表面抗原
● 高选择性与细胞内的滞留能力
产品概述
近年来，以细胞表面抗原为目标的癌症治疗和诊断的相关研究引起了科研人员的广泛关注。目前较为常用的方法是利用荧光标记的抗体来检测细胞表面抗原(免疫荧光法)，但是由于许多细胞表面蛋白的表达水平不高，往往造成检测结果灵敏度低、适用范围小的问题。针对这些问题，同仁化学研究所专门开发了一种高灵敏度的荧光染色方法，即CLAMP法(quinone methide-based catalyzed signal amplification)。
*本产品是在日本九州大学片山佳树教授的指导下研制而成。
检测原理
通过利用一抗、β-Galactosidase(β-Gal)标记的二抗、β-Gal的荧光底物CLAMP F405进行荧光染色。CLAMP F405自身没有荧光也无法通过细胞膜，在与β-Gal反应后会形成具有细胞膜透过能力的Quinone methide，在进入细胞后可以与细胞内氨基和巯基结合并发出荧光。因为该荧光强度经过β-Gal的酶反应而得到增强，因此可以高灵敏的检测细胞膜上蛋白质。
参考文献：Noguchi, K. et al., “β-Galactosidase-Catalyzed Fluorescent Reporter Labeling of Living Cells for Sensitive Detection of Cell Surface Antigens”, Bioconjugate Chem., 2020, 31(7), 1740–1744.
操作简单、灵敏度高
CLAMP法的操作步骤与一般的二抗法相同。依次加入目的蛋白对应的一抗、β-gal标记的二抗、染色液，简单的三步操作后即可开始检测。
实验例
PD-1L1性能比较表
同时准备PD-L1诱导表达的HepG2细胞以及作为对照组的CFSE染色的细胞。将这两个细胞样品混合后，用CLAMP检测PD-L1表达的细胞。从结果可以看出，在CFSE染色细胞中，没有任何CLAMP法阳性细胞出现，PD-L1表达的细胞被清楚地标记区分出来。说明CLAMP可以用于检测一般的二次抗体法很难检测出来的PD-L1表达的HepG2细胞。
*CFSE: 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3‘,6’-diacetate。(同仁货号：C375)
<检测结果>
<检测条件>
Blue: Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm
Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm
FFPE组织切片-人小肠组织
分别用CLAMP法和酪酰胺信号放大法(TSA, Tyramide signal amplification)检测人小肠FFPE组织切片上的α 平滑肌肌动蛋白(αSMA, α-smooth muscle actin)和角蛋白。结果显示CLAMP法的灵敏度更高，并且清晰的呈现了组织的免疫荧光共染色。
*数据提供：日本京都大学医学部附属医院病理诊断科 平田胜启老师
操作步骤实验例
① Protocol 1 (实验例：荧光显微镜检测HeLa细胞的表面抗原CD44)
参照操作说明书的Protocol 1，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。
<检测条件>
1. 将HeLa细胞(1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。
2. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS) 培养基清洗2次。
3. 去除上清，加入100 µl μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, abcam) /MEM (10% FBS) ，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。
4. 去除上清，用100 µl MEM (10% FBS)培养基清洗2次。
5. 加入100 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体（ab136774, abcam）/MEM (10% FBS)，37℃，5% CO2培养箱内培养1 h。
6. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞2次。
7. 加入100 µl Staining Solution，37℃，5% CO2培养箱内培养30 min。
8. 去除上清，用100 µl HBSS清洗细胞3次。
9. 用荧光显微镜观察荧光。（DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm）
② Protocol 2 (实验例：流式细胞仪检测HeLa细胞的表面抗原CD44)
参照操作说明书的Protocol 2，用CLAMP法检测HeLa细胞上的表面抗原CD44。
<检测条件>
1. 在1.5 ml微管中用MEM培养基(10% FBS) 制成2 x 105 cells/tube HeLa细胞的细胞悬液。
2. 300×g离心5 min，去除上清。
3. 添加500 µl 2 μg/ml CD44抗体(ab189524, abcam)/MEM培养基(10% FBS)，吹打混匀。
4. 在37℃静置1 h。
5. 按下列步骤进行清洗。
Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl培养基吹打制成细胞悬液。
Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。
6. 加入500 µl x500 β-Galactosidase标记的抗体(ab16774, abcam) /MEM培养基(10% FBS)，吹打制成细胞悬液。
荧光二抗法使用Alexa Fluor405标记的抗体 (ab175652, abcam)
7. 在37℃静置1 h。
8. 用HBSS替代培养基，重复步骤5的清洗操作，
9. 加入500 µl用HBSS配制的Staining Solution(悬浮细胞用)，吹打制成细胞悬液。
10.在37℃下，用微管旋转器(Tube Rotator)搅拌30 min。注意：不搅拌的话会造成灵敏度降低。
11. 300×g离心5 min，去除上清。
12.加入500 µl HBSS吹打混匀。
13.上流式细胞仪检测(LSR Fortessa X-20, BD)。 *BV421 filter set (Ex:405 nm, Em:430-470 nm)
③ Protocol 3 (实验例：检测固定化HeLa细胞的表面抗原CD44)
参照操作说明书的Protocol 3，用CLAMP法检测固定化HeLa细胞上的表面抗原CD44。
<检测条件>
PFA固定细胞的准备
1. 将HeLa细胞 (1 x 105 cell/ml)播种于96孔板(100 μl/well)，37℃，5% CO2培养箱内过夜培养。
2. 去除上清，用100 µl PBS清洗2次。
3. 加入100 µl 4% PFA/PBS溶液，室温静置30 min。
4. 去除上清，加入100 µl 0.1% Triton X-100/PBS溶液，室温静置30 min。
5. 去除上清，每孔加入100 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，室温静置30 min。
染色步骤
1. 去除上清，加入100 2 μg/ml 抗CD44抗体 (ab189524, Abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。
2. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。
3. 加入100 µl x500 β-Galactosidase 标记的抗体 (ab16774, abcam) /Blocking Buffer ，室温静置1 h。
4. 去除上清，用100 µl Blocking Buffer清洗2次。
5. 加入100 µl Staining Solution，37℃静置30 min 。
6. 去除上清，用100 µl PBS清洗细胞3次。
7. 用荧光显微镜观察荧光。(DAPI filter: Ex = 320-360 nm, Em = 435-480 nm)
④ Protocol 4 (实验例：检测固定化MOLT4细胞的表面抗原PD1)
参照操作说明书的Protocol 4，用CLAMP法检测固定化MOLT4细胞上的表面抗原PD1。
<检测条件>
PFA细胞固定的准备
1. 在1.5 ml微管中加入(2 x 105 cells/tube)MOLT4细胞制成细胞悬液。
2. 300×g离心5 min，去除上清。
3. 添加500 µl 4% PFA/PBS溶液，吹打混匀。
4. 室温静置30 min，300×g离心5 min。
5. 去除上清，加入500 µl 0.1% TritonX-100/PBS溶液，吹打混匀。
6. 室温静置30 min，300×g离心5 min。
7. 去除上清，加入500 µl Blocking Buffer (10% Blocking One/PBS)，吹打混匀。
8. 去除上清后用100 µl HBSS清洗3次。
9. 室温静置30 min，300×g离心5 min，去除上清后开始染色步骤。
染色步骤
1. 加入500 µl 1 μg/ml PD1抗体(ab52587, abcam)/Blocking Buffer，吹打混匀。(同型对照使用IgG1KAPPA, 401408, Biolegend)
2. 室温静置1 h。
3. 按下列步骤进行清洗。
Ⅰ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅱ. 加入500 µl Blocking Buffer吹打制成细胞悬液。
Ⅲ. 300×g离心5 min，去除上清。 Ⅳ. 再重复一次步骤Ⅱ和Ⅲ。
4. 加入<span style=”font-size: 11px; font-family: Arial; color: blac
FAQ
| Q：目前有染色实例的细胞和抗原有哪些？ |
| A：请参考下表：
|
| Q：染色后的样品可以保存吗 |
| A：活细胞在染色后再进行PFA固定的样品可以在PBS中冷藏保存1周。已经固定好的细胞再进行染色，在PBS中也可冷藏保存1周。 |
| Q：内源性β-Galactosidase是否会影响染色结果？ |
| A：活细胞染色时，CLAMP F405无法通过细胞膜，所以不会与内源性β-Galactosidase反应。而固定细胞染色时，按照书名数要求需要在PBS溶液中进行染色，一般也不会产生背景荧光上升的问题。 |
| Q：是否可以用PBS和HBSS以外的缓冲液来配制Staining Solution？ |
| A：中性以外的缓冲液会对染色反应有影响，所以不推荐使用。 |
| Q：各仪器的推荐检测条件？ |
| A：普通荧光显微镜：DAPI filter, Ex = 320-380 nm, Em = 435-485 nm
激光共聚焦显微镜：Ex = 405 nm, Em = 425-475 nm 流式细胞仪：Ex = 405nm, Em：BV421, Pacific Blue (450/50 nm) |
| Q：我从哪里可以购买到β-Gal标记的二次抗体？ |
| A：同仁化学并不销售一抗和标标记好的二抗，下面是我们实际检测过并实验成功的抗体和厂家。
|
| Q：CLAMP F405-Signal Boosting的DMSO溶液是否可以反复冻融？ |
| A：我们尝试过20次的反复冻融，对产品性能没有影响。 |
| Q：配置好的Staining Solution是否可以长期保存？ |
| A：Staining Solution 无法长期保存，请现配现用。 |
| Q：是否可以用PBS和HBSS以外的缓冲液来配制Staining Solution？ |
| A：中性以外的缓冲液会对染色反应有影响，所以不推荐使用。 |
| Q：各仪器的推荐检测条件？ |
| A：普通荧光显微镜：DAPI filter, Ex = 320-380 nm, Em = 435-485 nm
激光共聚焦显微镜：Ex = 405 nm, Em = 425-475 nm 流式细胞仪：Ex = 405nm, Em：BV421, Pacific Blue (450/50 nm) |
| Q：如果荧光的背景高，有哪些改善的建议？ |
| A：请按照操作说明书上的“抗体浓度预实验”的步骤预先摸索最佳抗体浓度。另外，对于悬浮细胞样品，在染色时请务必使用微管旋转器时刻保持微管内的悬浊状态。以上两种方法都可以降低背景荧光。 |
| Q：如果观察不到荧光，有哪些改善的建议？ |
| A：重新配置Staining Solution，并且在37℃下染色30-60分钟。如果还是观察不到荧光，有可能是抗体的浓度不合适，请按照操作说明书上的“抗体浓度预实验”的步骤预先摸索最佳抗体浓度 |
C12H21N5O4S
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试剂盒内含
规格性状
性状：该产品为白色至微黄色粉末，溶于二甲基亚砜。
纯度（HPLC）：90.0％以上
二甲基亚砜可溶：测试合格
产品概述
已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2基）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH基）。
根据目的，有必要选择在抗生物素蛋白识别的生物素头和反应性基团之间的间隔物的长度，但是通常，间隔物越长，当抗生物素蛋白结合时，对抗体的抗原识别活性越强。可以认为，间隔物的影响可能引起非特异性吸附，并且在测量期间的背景可能很高。因此，为了提高测量灵敏度，请查看S/N（信噪比）。必须选择适当长度的垫片。
间隔基通常使用氨基己酸，并且存在一种化合物，其中一个分子的氨基己酸通过酰胺键被引入生物素中，并且该化合物中的两个分子被引入。由于己酸间隔物变长，水溶性变差，因此通常将生物素标记试剂溶解在DMSO中并添加到含有蛋白质的缓冲液中的方法是普遍的。
当在用氨基标记蛋白质时不能使用有机溶剂时，可以使用具有磺酸基的活性酯化合物。此外，在与巯基的反应中，以相同的方式使用由DMSO制备的溶液，但是由于其在间隔部分具有哌嗪结构，因此通过质子化在中性区域显示水溶性。
用于还原糖的生物素酰肼化合物的水溶性低，需要在DMSO溶液中进行调节。
在ELISA（酶联免疫吸附测定）中，将酶标记的链霉亲和素与生物素标记的抗体结合的方法是常见的。与抗生蛋白链菌素相比，抗生物素蛋白便宜，但很少用于ELISA中。原因是背景极高，并且认为高PI是原因。抗生物素蛋白通常用于通过柱分离生物素结合蛋白等的目的。
原理
操作步骤
产品使用步骤:
1. 制备含巯基的抗体
1) 用PBS溶解DTT (浓度为200mmol/l)，制成DTT溶液。
2) 精确称量1.0-5.0mg抗体并记录，加入500ul 10mmol/l HEPES Buffer (pH8.0) 溶解蛋白质，制成抗体溶液。
3) 在抗体溶液加入2ul DTT溶液，充分混合。
2. 凝胶过滤纯化
1) 打开NAP-5层析柱上的盖子，弃去填充液。
2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。
3) 用移液器吸取500μl标记好的抗体溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。
4) 在层析柱的出口处放置一根管子，在层析柱中加入1mlPBS，收集流出的抗体。
3. 生物素标记
1) 用DMSO溶解Biotin-PE-maleimide (浓度为50mmol/l，4.7mg/200ul或10mg/424ul)。
＊用Biotin-PEAC5-maleimide时浓度为5.9mg/200ul或10mg/342ul。
2) 在纯化好的抗体溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，抗体：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:10左右。
3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25℃)中过夜培养。
4. 标记抗体的凝胶过滤纯化
1) 打开NAP-10层析柱上的盖子，弃去填充液。
2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约15ml的洗脱液，使凝胶平衡。
3) 用移液器吸取1ml标记好的抗体溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。
4) 在层析柱的出口处放置一根管子，在层析柱中加入1.5ml PBS，收集流出的生物素标记抗体。
参考文献
1) S. Hashida, M. Imagawa, S. Inoue, K. H. Ruan and E. Ishikawa , “Mor Useful Maleimide Compounds for the Conjugation of Fab’ to Horseradish Peroxidase throuth Thiol Groups in the Hinge”, J. Appl. Biochem., 1984, 6, 56.
2) E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Toshitake, Y. Hamaguchi and T. Ueno, “Enzyme-labeling of Antibodies and their Fragments for Enzyme Immunoassay and Immunohistochemical Staining”, J. Immunoassay, 1983, 4, 209.
3) H. -J. Friesen, P. Hermentin and P. Gronski, “Novel Maleimido-Biotins for the Selective Biotinylation of Sulfhydrils”, Protides Biol. Fluids, 1987, 34, 43.
4) E. Ishikawa, S. Hashida, T. Kohno, T. Kotani and S. Ohtani, “Modification of Monoclonal Antibodies with Enzymes, Biotin, and Fluorochromes and Their Applications”, Immunol. Ser., 1987, 33, 113.
5) R. B. del Rosalio and R. L. Wahl, “Disulfide Bond-targeted Radiolabeling : Tumor Specificity of a Streptavidine-biotinylated Monoclonal Antibody Complex”, Cancer Res. (Suppl.), 1990, 50, 804S.
