藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白，它的荧光强度要比化学荧光探针，如荧光素和罗丹明高得多。因此，用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。别藻蓝蛋白(APC)是一种藻胆蛋白，它在660nm附近有红色荧光，激发波长为488nm。Allophycocyanin Labeling Kit-SH能够简便快速地制备被APC标记的IgG，SH-reactive APC（该试剂盒的成分之一）具有一个马来酰亚胺基，不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的巯基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube能够快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记所需的全部溶液，包括制备带有SH的还原型IgG所需的还原剂以及储存标记产物的Storage buffer。

*APC: Allophycocyanin (别藻蓝蛋白)

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者Phycobiliprotein-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

标记IgG操作步骤：

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）

（2）用移液器使溶液混合，然后8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（3）将150μl WS buffer加入到Reducing agent中并用移液器吹打数次使其溶解。

（4）从步骤3所得的溶液中，取100μl转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（5）用移液器吹打数次后，37℃培养30分钟。

（6）将100μl RA solution加入到管中，8,000-10,000g离心10分钟。弃滤液，加入200μl RA solution，再离心一次。^b）

（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive APC并吹打其溶解。

（8）将所得的SH-reactive APC溶液转移到被还原的IgG所集中的过滤管的膜上。

（9）用移液器吹打数次后，37℃培养1小时。

（10）加入150μl WS buffer并吹打10-15次来回收标记产物。^c）将该溶液转移至0.5ml试管中，在0-5℃下保存。^d）

a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个APC分子。没有被结合的APC可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。

d）通常APC标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。

1）APC标记的产品可以在大约2.5小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50-200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）还可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。

6）可以使用随附的保存溶液保存APC标签。

*还原剂针对减少IgG的制备而优化。当使用带有除IgG以外的S-S键的样品时，由于S-S键的断裂，可能会失去待标记分子的活性。请在确认不会发生因还原引起的失活后使用。

该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的碱性磷酸酶标IgG以及竞争性EIA所需的碱性磷酸酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive ALP能够与含有SH的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive ALP可以和靶分子形成共价键，还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当碱性磷酸酶标IgG用于EIA时，SH-reactive ALP的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。

* ALP：Alkaline Phosphatase (碱性磷酸酶)

使用注意事项:

1. 所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000。

3. 标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。

4. 如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化 (不包含于此试剂盒中)。

5. 如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。

6. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶SH-reactive ALP放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤：

（1）将100μl Solution A以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）

（2）用移液器使溶液混合，8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（3）将150μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。

（4）将100μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（5）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养30分钟。

（6）将100μl Solution B加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟。除去滤液，加入200μl Solution B，再离心一次。^b）

（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive ALP中并用移液器吹打使其溶解。

（8）将SH-reactive ALP溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（9）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养1小时。

（10）加入150μl Storage buffee并吹打10-15次来回收标记产物。^c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管，将其储存在0-5℃。^d）

a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上被标记上2到4个碱性磷酸酶分子。没有被结合的碱性磷酸酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。

d）通常碱性磷酸酶标记后的还原型IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以在-20℃下存放。但还要注意样品自身是否稳定。

标记小分子操作步骤：

（1）用Reaction buffer制备50μl，1mM的巯基化合物溶液，^a）并将该溶液加入到SH-reactive ALP管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。

（2）将100μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。

（3）在8,000-10,000g离心10分钟，^b）弃滤液，向管中加入200μl Solution A。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。^c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。^d）

a）如果巯基化合物在水溶液中无法溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl与45μl Reaction buffer混合。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记后产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1-2个靶分子能够和1个碱性磷酸酶分子结合。

d）建议用Storage Buffer来回收标记产物，也可以选择其它合适的缓冲液。

1）可以在大约3个小时内制备ALP标记的产品。

2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）只需与SH反应性ALP混合即可形成ALP标签。

5）还可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。

6）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

7）带有ALP标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。