分子式:
C10H18N2O6
分子量:
262.26
分子式:
C10H18N2O6
分子量:
262.26
特点:
● 灵敏度高,操作简便
● 操作简单三步即可完成实验
● 无需清洗细胞
产品解说
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒使用Fatty Acid Uptake Probe作为脂肪酸类似物,通过位于细胞膜表面的脂肪酸转运蛋白进入细胞,可以通过荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪等荧光测量方法检测细胞的摄取能力。此外,该试剂盒配备了Quenching Buffer,可消除未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe的荧光,因此无需清洗细胞也可以检测。
检测产品优势
为什么脂肪酸摄取能力越来越受到关注?
脂肪酸是为生物体供应能量的重要物质。脂肪酸摄取能力不仅与肥胖和糖尿病等疾病有关,也是癌细胞的代谢指标之一(左下图)。细胞增殖活跃的癌细胞往往需要很多脂质,所以细胞内的脂肪酸合成和细胞外的脂肪酸摄取很活跃(右下图)。因此,以癌细胞的脂肪酸代谢途径为目标,开发了很多药物。
用单个试剂盒即可解决整个脂肪酸摄取实验!
本试剂盒所内含的脂肪酸类似物通过脂肪酸转运体被转运至细胞内,再通过荧光探针(荧光法)检测该类似物的摄入量【检测原理】。Quenching buffer可以省去清洗操作的麻烦和时间成本,进行检测【操作步骤】。
检测原理
操作步骤
检测仪器
HepG2细胞通过添加脂肪酸转运蛋白抑制剂CB-2,在不同仪器中检测其脂肪酸摄取能力的变化。
选择指南
Washing Buffer或Quenching Buffer的选择指南
请参考下表,根据细胞种类和实验系统(操作和测量装置)选择Washing Buffer或Quenching Buffer。
〇:可测量、×:不可测量、△:参考注释
Washing Buffer (10×) | Quenching Buffer | ||||
贴壁细胞 | 悬浮细胞 | 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||
清洗操作 | 必要 | 不需要 | |||
荧光酶标仪 | 底部读数(透明底) | 〇 | 〇 | △※1 | |
顶部读数 | 〇 | × | |||
荧光显微镜 | 〇 | 〇 | |||
激光共聚焦显微镜 | 〇 | △※2 | |||
流式细胞仪 | 〇 | × |
※1接种的细胞需要覆盖板底(大约:3x105cells/well),使之静置一段时间,从而可检测在板底的贴壁细胞。
※2使用激光共聚焦显微镜时,请将Quenching Buffer用Washing Buffer稀释10倍后使用,如果不能使用ex:488nm,请使用ex:640nm进行检测。
实验例
确认细胞中脂肪酸代谢状态
在A549细胞中添加不含葡萄糖或含有25mmol/l葡萄糖的DMEM培养基,制备了正常状态(control)和饥饿状态(Starved)的两组细胞。使用本试剂盒对两组细胞进行染色,并使用荧光显微镜观察。
结果显示,在对照组细胞中,荧光素大多聚集在脂肪滴中,而在饥饿状态的细胞中荧光素主要集中在线粒体和内质网上。由此可看出在饥饿状态下的细胞脂肪酸代谢的变化。
对照组细胞和饥饿组细胞的荧光图
*供参考的可检测数:35 mm dish 10块、 96孔板 1 块
产品Q&A
Q: 可用于哪些种类的细胞 |
A:在下述细胞中有使用实例。 |
细胞 | 由来 |
A549 | 人肺泡基底上皮腺癌细胞 |
HepG2 | 人肝癌细胞 |
HeLa | 人宫颈癌细胞 |
Jurkat | 人白血病T细胞 |
MOLT-4 | 人急性淋巴白血病细胞 |
3T3-L1 (preadipocyte) | 前脂肪細胞 |
3T3-L1 (adipocyte) | 脂肪細胞 |
Q: 将Fatty Acid Uptake Probe孵育进活细胞后,可以固定细胞吗? |
A:<实验例>使用4%PFA固定染色后的细胞实验案例
Protocol:贴壁细胞 1. 将制备好的细胞接种在培养皿或96孔板上; 2. 用无血清培养基洗涤两次; 3. 加入无血清培养基,在培养箱(37℃,5%CO2存在下)中静置孵育15 min; 4. 去除上清液,添加Fatty Acid Uptake Probe working solution,在培养箱(37℃、5%CO2存在下)中静置15 min; 5. 去除上清液,用Washing Buffer solution清洗1次; 6. 向细胞中加入4%PFA/PBS并在室温下孵育5 min; 7. 用PBS洗涤细胞3次,用荧光显微镜检测,荧光酶标仪检测。 ※固定会降低荧光强度 悬浮细胞 1. 取细胞样品至微管中; 2. 300×g离心5min,去除上清液; 3. 加入无血清培养基,300×g离心5min,去除上清液,重复两次; 4. 加入无血清培养基,混匀细胞,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min; 5. 300×g离心5 min,去除上清液; 6. 加入Fatty Acid Uptake Probe working solution,混匀细胞,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min ; 7. 300×g离心5min,去除上清液; 8. 用Washing Buffer solution清洗一次; 9. 加入4%PFA/PBS,混匀细胞,在室温下孵育5 min; 10. 300×g离心5 min,去除上清液; 11. 加入PBS,混匀细胞,300×g离心5 min,去除上清液;重复两次。 12. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测。 |
Q: 用荧光酶标仪检测时,应该用哪种板子? |
A: 检测荧光,请使用细胞培养用的黑色孔板。 |
〇:可使用、×:不可使用、△:参考注释
贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||||
不透明底 | 透明底 | 不透明底 | 透明底 | ||
Washing Buffer (10×) | Top Reading | 〇 | 〇 | ||
Bottom Reading | × | 〇 | × | 〇 | |
Quenching Buffer | Top Reading | × | × | ||
Bottom Reading | × | 〇 | × | △※ |
※接种的细胞需要覆盖板底,使之静置一段时间,从而可检测在板底的贴壁细胞。
〈使用Quenching Buffer时,悬浮细胞的数据〉
实验案例使用孔板:
厂家 | 产品名 | Cat No. |
ibidi | µPlate 96 well ibiTreat black S 15 | ib89626 |
Thermo Fisher | 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10 | 165305 |
Q: Fatty Acid Uptake Probe working solution可以保存吗? |
A:无法保存。 |
Q:背景较高怎么办? |
A:样品中可能存在未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe。可重复使用Washing Buffer solution清洗,或者考虑使用Quenching Buffer。 |
Q:试剂盒可检测的样品数量是多少? |
A:请参照下表。 |
贴壁细胞 | 悬浮细胞 | ||||
培养皿
(添加量) |
6 well
(1.5 ml/well) |
24-well
(0.3 ml/well)
|
96-well
(0.1 ml/well)
|
35-mm dish
(1.5 ml/well)
|
1.5-ml microtube
(0.5 ml/tube)
|
样本数 | 7 sample | 34 sample | 100 sample | 7 sample | 20 sample |
Q:使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测,应该怎么做? |
A:使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测时,请将Quenching Buffer用Washing Buffer solution稀释10倍后使用,或者使用640nm激发光检测。
<用用激光共焦显微镜进行透射光观察时所看到的现象> |
Q:可以进行脂肪酸定量吗? |
A:不能使用本产品定量脂肪酸。 |
Q:可以量化细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe吗? |
A:无法定量细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe。该试剂是为了确认脂肪酸摄取能力的增减的配合用试剂。 |
Q:可以和其他荧光染料共染吗? |
A:Fatty Acid Uptake Probe是使用红色荧光观察。因此,请使用绿色或者红色荧光检测以外的试剂进行共染色。
与本公司线粒体染色试剂MitoBright LT Deep Red(MT12)共染色的实绩。 〈进入红色荧光〉 〈与MitoBright LT Deep Red共染色〉 1. 制备细胞样品接种到培养皿或者孔板中; 2.去除培养基,用无血清培养基洗涤两次; 3.加入无血清培养基,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min; 4.去除上清液后,添加Fatty Acid Uptake Probe working solution,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min; 5. 去除上清液后,添加0.1µmol/l MitoBright LT working solution,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置30 min; 6. 去除上清液后,用HBSS洗涤两次; 7.加入HBSS并用荧光显微镜观察。 |
Q: 荧光显微镜观察时有什么注意事项吗? |
A:荧光显微镜观察时,如果持续照射激发光,Fatty Acid Uptake Probe的荧光可能会淬灭。请控制连续的激发光的照射次数。 |
C22H20K4N2O10
628.79
性质
酸解离常数为pKa3 = 5.47和pKa4 = 6.36,金属离子的稳定常数为logKCa = 6.97和logKMg = 1.77。 因此,它是接近中性的Ca2 +的选择性螯合剂。
长期以来,GEDTA被认为是一种选择性捕获钙的螯合剂。 GEDTA首先证明了钙在肌肉收缩研究中的重要性。 如果要在生理pH条件(pH值为7)下进行实验,则需要将GEDTA的酸解离常数进一步降低2到3个数量级,以抑制质子化的副反应。
Tsien等人通过合成BAPTA(一种使用芳族胺而不是脂肪族胺的螯合剂)达到了这一要求。 下面是GEDTA和BAPTA常数值的比较,图中显示了各种Ca2 +配合物的条件常数与pH之间的关系。 可以看出,即使接近中性,BAPTA也不容易受到质子的影响。
各种钙离子螯合剂的条件常数与pH的关系
溶解例
1.8 g/50 mL(水)
规格性状
规格性状:
本产品为白色粉末或结晶性粉末,可溶于水。
纯度(滴定,干物质转化率):95.0%或更高
水溶性:测试合格
PH(25°C):8.0-9.5
水分:3.5至14.0%或更高
灼烧残渣(硫酸盐):46.0-53.0%或更高
红外光谱:测试合格
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