THP-1 细胞对标记凋亡细胞的吞噬作用实验
AcidSensor 标记的物质会被细胞吸收,当它们到达溶酶体等酸性细胞器时,荧光会增强。利用这一特性,我们通过将 AcidSensor 标记的凋亡细胞与 Calcein 标记的 THP-1 巨噬细胞共培养来评估凋亡细胞的吞噬活性。 结果,通过流式细胞术观察到了钙蓝蛋白(绿色)/AcidSensor(深红色)双阳性细胞,表明 THP-1 巨噬细胞吞噬了凋亡细胞(图 1a)。此外,当细胞松弛素 D 抑制 THP-1 巨噬细胞的吞噬作用时,双阳性细胞的比例也会下降(图 1b 和 1c),这证实该检测系统能准确评估吞噬作用。
最近的一份报告显示,抑制线粒体功能会诱导培养的小胶质细胞(中枢神经系统中的常驻巨噬细胞)转向糖酵解并减少吞噬作用*。为了复制这一结果,我们使用线粒体抑制的 THP-1 巨噬细胞进行了吞噬试验。结果显示,短链氯化石蜡是线粒体氧化磷酸化的强效解偶联剂,它能降低 THP-1 巨噬细胞的线粒体膜电位(MT-1,红色)(图 2)并减少吞噬作用(图 3)。
使用产品:
①AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 【货号: A558】
② -Cellstain- Calcein-AM 【货号:C542】
③ MT-1 MitoMP Detection Kit 【货号:MT13】
实验步骤:
制备 AcidSensor 标记的凋亡细胞(检测前一天)
1. 向 NH2-Reactive AcidSensor 中加入 10 μl DMSO 并溶解。将 5 μl NH2-Reactive AcidSensor 溶液加入 5 ml HBSS,制成工作液(稀释 1000 倍)。
2. 用 HBSS 冲洗 Jurkat 细胞两次。
3. 将 Jurkat 细胞(5×107 个)转移到试管中,离心后去除上清液。
4. 将工作液加入到装有 Jurkat 细胞(5×107 个)的试管中并悬浮。
5. 5. 37°C 孵育 30 分钟,用 AcidSensor 进行标记。
6. 标记后,用 HBSS 冲洗细胞两次。
7. 将标记了 AcidSensor 的 Jurkat 细胞悬浮在含有 10%FBS、添加了 0.5 μM 石杉碱的 RPMI 培养基中。
8. 在培养箱(37°C,5% CO2)中隔夜培养 18 小时,诱导细胞凋亡。
使用 THP-1 巨噬细胞进行吞噬试验
1. 为了将 THP-1 细胞分化成巨噬细胞,将 THP-1 细胞以 1×106 个细胞/孔的数量播种到 6 孔板中,然后在培养箱中用 100 nM PMA 培养 3 天。
2. 2. 用 HBSS 冲洗 THP-1 巨噬细胞两次后,在孔中加入含 HBSS 溶液的 Calcein-AM(货号:C542,0.5 μg/ml)和 MT-1(货号:MT13,1000 倍稀释),在培养箱中培养 30 分钟。
3. 用培养液清洗两次。
4. 用 10 μM Cytochalasin D培养 1 小时,或用 5 μM FCCP 培养 30 分钟。
5. 用培养液清洗两次后,将 AcidSensor 标记的凋亡细胞(3×106 个细胞/孔)加入到含有或不含细胞松驰素 D 或 FCCP 的孔中。细胞在培养箱中培养 4 小时。
6. 用 HBSS 冲洗两次。
7. 加入 500 μl Imaging 缓冲溶液(货号:MT13),用细胞刮板收集平板上的 THP-1 巨噬细胞。
8. 用流式细胞仪分析细胞悬浮液。