线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

发表于2024年9月24日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体膜电位检测试剂盒

JC-1 MitoMP Detection Kit

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 灵敏度高

● 易上手

● 多种仪器均可检测

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1set

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可使用于各种仪器

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试剂盒内含

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中¹⁾。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关²⁾³⁾。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

参考文献

No.	Sample Type	Instrument	Reference
1	Cell:A549	Microscope	K. Li, S. Sun, L. Xiao and Z. Zhang, “Bioactivity-guided fractionation of Helicteres angustifolia L. extract and its molecular evidence for tumor suppression”, Front Cell Dev Biol.,2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1157172.
2	Cell:A549	Flow Cytometer	C. N. D’Alessandro-Gabazza, T. Yasuma, T. Kobayashi, M. Toda1, A. M. Abdel-Hamid, H. Fujimoto, O. Hataji, H. Nakahara, A. Takeshita, K. Nishihama, T. Okano, H. Saiki, Y. Okano, A. Tomaru, V. F. D’Alessandro, M. Shiraishi, A. Mizoguchi, R. Ono, J. Ohtsuka, M. Fukumura, T. Nosaka, X. Mi, D. Shukla, K. Kataoka, Y. Kondoh, M. Hirose, T. Arai, Y. Inoue, Y. Yano, R. I. Mackie, I. Cann and E. C. Gabazza, “Inhibition of lung microbiota-derived proapoptotic peptides ameliorates acute exacerbation of pulmonary fibrosis”, Nat. Comm., 2022, doi:10.1038/s41467-022-29064-3.
3	Cell:A549, HeLa	Plate reader	J. Yang, L. Liu, Y. Oda, K. Wada, M. Ago, S. Matsuda, M. Hattori, T. Goto, Y. Kawashima, Y. Matsuzaki and T. Taketani,”Highly-purified rapidly expanding clones, RECs, are superior for functional-mitochondrial transfer”, Stem Cell Res Ther., 2023, doi: 10.1186/s13287-023-03274-y.
4	Cell:ALM	Plate reader	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5	Cell:ARPE-19	Flow Cytometer/	J. Hamuro, T. Yamashita, Y. Otsuki, N. Hiramoto, M. Adachi, T. Miyatani, H. Tanaka, M. Ueno, S. Kinoshita and C. Sotozono,”Spatiotemporal Coordination of RPE Cell Quality by Extracellular Vesicle miR-494-3p Via Competitive Interplays With SIRT3 or PTEN”, Invest Ophthalmol Vis Sci., 2023, doi: 10.1167/iovs.64.5.9.
6	Cell:ARPE-19	Microscope	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine., 2020, 15, 3695–3716.
7	Cell:C2C12, myocytes	–	Z. Jing, T. Iba, H. Naito, P. Xu, J.I. Morishige, N. Nagata, H. Okubo and H.Ando ,”L-carnitine prevents lenvatinib-induced muscle toxicity without impairment of the anti-angiogenic efficacy”, Front Pharmacol., 2023, doi: 10.3389/fphar.2023.1182788.
8	Cell:C2C12, 3T3L1	Plate reader	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
9	Cell:Colon 26	Microscope	B. Uranbileg, M. Kurano, K. Kano, E. Sakai, J. Arita, K. Hasegawa, T. Nishikawa, S. Ishihara, H. Yamashita, Y. Seto, H. Ikeda, J. Aoki and Y. Yatomi,”Sphingosine 1‐phosphate lyase facilitates cancer progression through converting sphingolipids to glycerophospholipids”, Clin Transl Med., 2022, doi: 10.1002/ctm2.1056.
10	Tissue: Frozen heart slides	Microscope	W. Yu, Y. Hu, Z. Liu, K. Guo, D. Ma, M. Peng, Y. Wang, J. Zhang, X. Zhang, P. Wang, J. Zhang, P. Liu and J. Lu,”Sorting nexin 3 exacerbates doxorubicin-induced cardiomyopathy via regulation of TFRC-dependent ferroptosis”, Acta Pharmaceutica Sinica B., 2023, doi: https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.08.016.
11	Cell:HCE	Microscope	T. Yamashita, K. Asada, M. Ueno, N. Hiramoto, T. Fujita, M. Toda, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”Cellular interplay through extracellular vesicle miR-184 alleviates corneal endothelium degeneration”, Ophthalmol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.xops.2022.100212.
12	Cell:HCE	Microscope	M. Ueno, K Yoshii, T. Yamashita, K. Sonomura, K. Asada, E. Ito, T. Fujita, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”The Interplay Between Metabolites and MicroRNAs in Aqueous Humor to Coordinate Corneal Endothelium Integrity”, Ophthalmol Sci., 2023, doi: 10.1016/j.xops.2023.100299.
13	Cell:HCE-T	–	W. Otsu, T. Yako, E. Sugisawa, S. Nakamura, H. Tsusaki, N. Umigai, M. Shimazawa and H. Hara,”Crocetin protects against mitochondrial damage induced by UV-A irradiation in corneal epithelial cell line HCE-T cells”, J Pharmacol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.jphs.2022.10.005.
14	Cell:HCE-T	Microscope	K. Ishida, T. Yako, M. Tanaka, W. Otsu, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Tsusaki and H. Hara,”Free-radical scavenger NSP-116 protects the corneal epithelium against UV-A and blue led light exposure”, Biol Pharm Bull., 2021, doi: 10.1248/bpb.b21-00017.
15	Cell:HepG	Microscope/Spectrophotometer	M. Ikura, K. Furuya, T. Matsuda and T. Ikura,”Impact of Nuclear De Novo NAD+ Synthesis via Histone Dynamics on DNA Repair during Cellular Senescence To Prevent Tumorigenesis”, Mol Cell Biol., 2022, doi: 10.1128/mcb.00379-22.
16	Cell:hiPSCs, Neurons	Microscope	T. Hara, M. Toyoshima, Y. Hisano, S. Balan, Y. Iwayama, H. Aono,Y. Futamura, H. Osada, Y. Owada and T. Yoshikawa,”Glyoxalase I disruption and external carbonyl stress impair mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells and derived neurons”, Translational Psychiatry., 2021, doi: 10.1038/s41398-021-01392-w.
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18	Cell:HUVECs	Microscope	D. Ueno, K. Ikeda, E. Yamazaki, A. Katayama, R. Urata and S. Matoba ,”Spermidine improves angiogenic capacity of senescent endothelial cells, and enhances ischemia-induced neovascularization in aged mice”, Sci Rep., 2023, doi: 10.1038/s41598-023-35447-3.
19	Cell:KYSE30	Microscope	Q. Luo, X. Wu, P. Zhao, Y. Nan, W. Chang, X. Zhu, D. Su and Z. Liu,”OTUD1 activates caspase‐independent and caspase‐dependent apoptosis by promoting AIF nuclear translocation and MCL1 degradation”, Adv Sci (Weinh)., 2021, doi: 10.1002/advs.202002874.
20	Cell: Macrophage	Microscope	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
21	Cell:MDA-MB-415, MCF-7	Microscope	S.Y. Park, K.J. Jeong, A. Poire, D. Zhang, Y.H. Tsang, A.S. Blucher and G.B. Mills ,”Irreversible HER2 inhibitors overcome resistance to the RSL3 ferroptosis inducer in non-HER2 amplified luminal breast cancer”, Cell Death & Disease., 2023, doi: 10.1038/s41419-023-06042-1.
22	Cell:MIN6	Plate reader/Microscope	N. Mizusawa, N. Harada, T. Iwata, I. Ohigashi, M. Itakura and K. Yoshimoto,”Identification of protease serine S1 family member 53 as a mitochondrial protein in murine islet beta cells”, Islets., 2022, doi: 10.1080/19382014.2021.1982325.
23	Cell:MSCs	Flow Cytometer	S.Y. Jo, H.J. Cho and T.M. Kim,”Fenoldopam mesylate enhances the survival of mesenchymal stem cells under oxidative stress and increases the therapeutic function in acute kidney injury”, Cell Transplant., 2023, doi: 10.1177/09636897221147920.
24	Cell:Neuro-2A	Microscope、Plate reader	Y. Wang, Y. Shinoda, A. Cheng, I. Kawahata and K. Fukunaga,”Epidermal fatty acid-binding protein 5 (FABP5) Involvement in alpha-synuclein-induced mitochondrial injury under oxidative stress”, Biomedicines., 2021, doi: 10.3390/biomedicines9020110.
25	Cell:Neuron	Microscope	I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
26	Cell:Neuron	Microscope	A. Fukuda, S. Nakashima,Y. Oda, K. Nishimura, H. Kawashima, H. Kimura, T. Ohgita, E. Kawashita, K. Ishihara, A. Hanaki, M. Okazaki, E. Matsuda, Y. Tanaka, S. Nakamura, T. Matsumoto, S. Akiba, H. Saito, H. Matsuda and K. Takata,”Plantainoside B in Bacopa monniera Binds to Aβ Aggregates Attenuating Neuronal Damage and Memory Deficits Induced by Aβ”, Biol Pharm Bull., 2023, doi: 10.1248/bpb.b22-00797.
27	Cell:PAECs	Plate reader	T. Sakai, H. Takagaki, N. Yamagiwa, M. Ui, S. Hatta and J. Imai,”Effects of the cytoplasm and mitochondrial specific hydroxyl radical scavengers TA293 and mitoTA293 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice”, Antioxidants (Basel)., 2021, doi: 10.3390/antiox10091398.
28	Cell:PANC-1	Plate reader	W.A. Naime, A. Kimishima, A. Setiawan, J.R. Fahim, M.A. Fouad, M.S. Kamel and M. Arai,”Mitochondrial Targeting in an Anti-Austerity Approach Involving Bioactive Metabolites Isolated from the Marine-Derived Fungus Aspergillus sp.”, Marine drugs., 2020, doi: 10.3390/md18110555.
29	Cell:PANC-1, MIAPaca-2	Microscope	T. Taniai, Y. Shirai,Y. Shimada, R. Hamura, M. Yanagaki, N. Takada, T. Horiuchi, K. Haruki, K. Furukawa, T. Uwagawa, K. Tsuboi, Y. Okamoto, S. Shimada, S. Tanaka, T. Ohashi and T. Ikegami,”Inhibition of acid ceramidase elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress in pancreatic cancer cells”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.15123.
30	Cell:PC	Flow Cytometer	R. Hamura, Y. Shirai,Y. Shimada, N. Saito, T. Taniai, T. Horiuchi, N. Takada, Y. Kanegae, T. Ikegami, T. Ohashi and K. Yanaga ,”Suppression of lysosomal acid alpha‐glucosidase impacts the modulation of transcription factor EB translocation in pancreatic cancer”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.14921.
31	Cell:Porcine oocytes	Microscope	W. Hu, Y. Zhang, D. Wang, T. Yang, J. Qi, Y. Zhang, H. Jiang, J Zhang, B. Sun and S. Liang,”Iron Overload-Induced Ferroptosis Impairs Porcine Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in vitro”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.673291.
32	Cell:Porcine oocytes	Microscope	Y. Xiao, B. Yuan, W. Hu, J. Qi, H. Jiang, B. Sun, J. Zhang and S. Liang,”Tributyltin Oxide Exposure During in vitro Maturation Disrupts Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in Pigs”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.683448.
33	Cell:RGC-5	Plate reader	Y. Aoyama, S. Inagaki, K. Aoshima, Y. Iwata, S. Nakamura, H. Hara and M. Shimazawa,”Involvement of endoplasmic reticulum stress in rotenone-induced leber hereditary optic neuropathy model and the discovery of new therapeutic agents”, J Pharmacol Sci . .,2021, doi: 10.1016/j.jphs.2021.07.003.
34	Cell:SAS,HSC-2	Plate reader	K. Yamana, J. Inoue, R. Yoshida, J. Sakata, H. Nakashima, H. Arita, S. Kawaguchi, S. Gohara, Y. Nagao, H. Takeshita, M. Maeshiro, R. Liu, Y. Matsuoka, M. Hirayama, K. Kawahara, M. Nagata, A. Hirosue, R. Toya, R. Murakami, Y. Kuwahara, M. Fukumoto and H. Nakayama,”Extracellular vesicles derived from radioresistant oral squamous cell carcinoma cells contribute to the acquisition of radioresistance via the miR‐503‐3p‐BAK axis”, J Extracell Vesicles., 2021, doi: 10.1002/jev2.12169.
35	Cell:SBC-3	Flow Cytometer	N. Takahashi, T. Iguchi, M. Kuroda, M. Mishima and Y. Mimaki,”Novel Oleanane-Type Triterpene Glycosides from the Saponaria officinalis L. Seeds and Apoptosis-Inducing Activity via Mitochondria”, Int J Mol Sci., 2022, doi: 10.3390/ijms23042047.
36	Cell:SH-SY5Y	Microscope	Q. Guo, I. Kawahata, A. Cheng, H. Wang, W. Jia, H. Yoshino and K. Fukunaga,”Fatty acid-binding proteins 3 and 5 are involved in the initiation of mitochondrial damage in ischemic neurons”, Redox Biology., 2023, doi: 10.1016/j.redox.2022.102547.
37	Cell:SiHa	Microscope	F.F. Gao, J.H. Quan, M.A. Lee, W. Ye, J.M. Yuk, G.H. Cha, I.W. Choi and Y.H. Lee,”Trichomonas vaginalis induces apoptosis via ROS and ER stress response through ER–mitochondria crosstalk in SiHa cells”, Parasites &vectors., 2021, doi: 10.1186/s13071-021-05098-2.
38	Cell:SU-DHL-2	Flow Cytometer	Q. Zhao, D. Jiang, X. Sun, Q. Mo, S. Chen, W. Chen, R. Gui and X. Ma,”Biomimetic nanotherapy: core–shell structured nanocomplexes based on the neutrophil membrane for targeted therapy of lymphoma”, J Nanobiotechnology., 2021, doi: 10.1186/s12951-021-00922-4.
39	Cell:THP-1	Microscope	W. Zheng, Z. Zhou, Y. Rui, R. Ye, F. Xia, F. Guo, X. Liu, J. Su, M. Lou, and X.F. Yu,”TRAF3 activates STING-mediated suppression of EV-A71 and target of viral evasion”, Signal Transduct Target Ther., 2023, doi: 10.1038/s41392-022-01287-2.
40	Cell:TSM15	In Cell Analyzer	M. Honda, F. Shimizu, R. Sato, Y. Mizukami, K. Watanabe, Y. Takeshita, T. Maeda, M. Koga and T. Kanda,”Jo-1 Antibodies From Myositis Induce Complement-Dependent Cytotoxicity and TREM-1 Upregulation in Muscle Endothelial Cells”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2023, doi: 10.1212/NXI.0000000000200116.
41	Cell:tumor	Flow Cytometer	H. Wang, X. Rong, G. Zhao, Y. Zhou, Y. Xiao, D. Ma, X. Jin, Y. Wu, Y. Yan, H. Yang, Y. Zhou, M. Qian, C. Niu, X. Hu, D.Q. Li, Q. Liu, Y. Wen, Y.Z. Jiang, C. Zhao and Z.M. Shao ,”The microbial metabolite trimethylamine N-oxide promotes antitumor immunity in triple-negative breast cancer”, Cell Metab., 2022, doi: 10.1016/j.cmet.2022.02.010.
42	Cell:TY10	In Cell Analyzer	F. Shimizu, R. Ogawa, Y. Mizukami, K. Watanabe, K. Hara, C. Kadono, T. Takahashi, T. Misu, Y. Takeshita, Y. Sano, M. Fujisawa, T. Maeda, I. Nakashima, K. Fujihara and T. Kanda,”GRP78 antibodies are associated with blood-brain barrier breakdown in anti–myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody–associated disorder”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2022, doi: 10.1212/NXI.0000000000001038.
43	Cell:U2OS, HeLa	Microscope	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25块板	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30块板	200 μl/孔
	96孔板	5块板	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

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JC-1 MitoMP Detection Kit

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储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 灵敏度高

● 易上手

● 多种仪器均可检测

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1set

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易溶解

可使用于各种仪器

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试剂盒内含

产品概述

产品特点

操作步骤

实验例

参考文献

常见问题Q&A

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NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

试剂盒内含

产品概述

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

2.初次使用也很容易上手

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

3.线粒体膜电位检测

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

参考文献

No.	Sample Type	Instrument	Reference
1	Cell:A549	Microscope	K. Li, S. Sun, L. Xiao and Z. Zhang, “Bioactivity-guided fractionation of Helicteres angustifolia L. extract and its molecular evidence for tumor suppression”, Front Cell Dev Biol.,2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1157172.
2	Cell:A549	Flow Cytometer	C. N. D’Alessandro-Gabazza, T. Yasuma, T. Kobayashi, M. Toda1, A. M. Abdel-Hamid, H. Fujimoto, O. Hataji, H. Nakahara, A. Takeshita, K. Nishihama, T. Okano, H. Saiki, Y. Okano, A. Tomaru, V. F. D’Alessandro, M. Shiraishi, A. Mizoguchi, R. Ono, J. Ohtsuka, M. Fukumura, T. Nosaka, X. Mi, D. Shukla, K. Kataoka, Y. Kondoh, M. Hirose, T. Arai, Y. Inoue, Y. Yano, R. I. Mackie, I. Cann and E. C. Gabazza, “Inhibition of lung microbiota-derived proapoptotic peptides ameliorates acute exacerbation of pulmonary fibrosis”, Nat. Comm., 2022, doi:10.1038/s41467-022-29064-3.
3	Cell:A549, HeLa	Plate reader	J. Yang, L. Liu, Y. Oda, K. Wada, M. Ago, S. Matsuda, M. Hattori, T. Goto, Y. Kawashima, Y. Matsuzaki and T. Taketani,”Highly-purified rapidly expanding clones, RECs, are superior for functional-mitochondrial transfer”, Stem Cell Res Ther., 2023, doi: 10.1186/s13287-023-03274-y.
4	Cell:ALM	Plate reader	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5	Cell:ARPE-19	Flow Cytometer/	J. Hamuro, T. Yamashita, Y. Otsuki, N. Hiramoto, M. Adachi, T. Miyatani, H. Tanaka, M. Ueno, S. Kinoshita and C. Sotozono,”Spatiotemporal Coordination of RPE Cell Quality by Extracellular Vesicle miR-494-3p Via Competitive Interplays With SIRT3 or PTEN”, Invest Ophthalmol Vis Sci., 2023, doi: 10.1167/iovs.64.5.9.
6	Cell:ARPE-19	Microscope	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine., 2020, 15, 3695–3716.
7	Cell:C2C12, myocytes	–	Z. Jing, T. Iba, H. Naito, P. Xu, J.I. Morishige, N. Nagata, H. Okubo and H.Ando ,”L-carnitine prevents lenvatinib-induced muscle toxicity without impairment of the anti-angiogenic efficacy”, Front Pharmacol., 2023, doi: 10.3389/fphar.2023.1182788.
8	Cell:C2C12, 3T3L1	Plate reader	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
9	Cell:Colon 26	Microscope	B. Uranbileg, M. Kurano, K. Kano, E. Sakai, J. Arita, K. Hasegawa, T. Nishikawa, S. Ishihara, H. Yamashita, Y. Seto, H. Ikeda, J. Aoki and Y. Yatomi,”Sphingosine 1‐phosphate lyase facilitates cancer progression through converting sphingolipids to glycerophospholipids”, Clin Transl Med., 2022, doi: 10.1002/ctm2.1056.
10	Tissue: Frozen heart slides	Microscope	W. Yu, Y. Hu, Z. Liu, K. Guo, D. Ma, M. Peng, Y. Wang, J. Zhang, X. Zhang, P. Wang, J. Zhang, P. Liu and J. Lu,”Sorting nexin 3 exacerbates doxorubicin-induced cardiomyopathy via regulation of TFRC-dependent ferroptosis”, Acta Pharmaceutica Sinica B., 2023, doi: https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.08.016.
11	Cell:HCE	Microscope	T. Yamashita, K. Asada, M. Ueno, N. Hiramoto, T. Fujita, M. Toda, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”Cellular interplay through extracellular vesicle miR-184 alleviates corneal endothelium degeneration”, Ophthalmol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.xops.2022.100212.
12	Cell:HCE	Microscope	M. Ueno, K Yoshii, T. Yamashita, K. Sonomura, K. Asada, E. Ito, T. Fujita, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”The Interplay Between Metabolites and MicroRNAs in Aqueous Humor to Coordinate Corneal Endothelium Integrity”, Ophthalmol Sci., 2023, doi: 10.1016/j.xops.2023.100299.
13	Cell:HCE-T	–	W. Otsu, T. Yako, E. Sugisawa, S. Nakamura, H. Tsusaki, N. Umigai, M. Shimazawa and H. Hara,”Crocetin protects against mitochondrial damage induced by UV-A irradiation in corneal epithelial cell line HCE-T cells”, J Pharmacol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.jphs.2022.10.005.
14	Cell:HCE-T	Microscope	K. Ishida, T. Yako, M. Tanaka, W. Otsu, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Tsusaki and H. Hara,”Free-radical scavenger NSP-116 protects the corneal epithelium against UV-A and blue led light exposure”, Biol Pharm Bull., 2021, doi: 10.1248/bpb.b21-00017.
15	Cell:HepG	Microscope/Spectrophotometer	M. Ikura, K. Furuya, T. Matsuda and T. Ikura,”Impact of Nuclear De Novo NAD+ Synthesis via Histone Dynamics on DNA Repair during Cellular Senescence To Prevent Tumorigenesis”, Mol Cell Biol., 2022, doi: 10.1128/mcb.00379-22.
16	Cell:hiPSCs, Neurons	Microscope	T. Hara, M. Toyoshima, Y. Hisano, S. Balan, Y. Iwayama, H. Aono,Y. Futamura, H. Osada, Y. Owada and T. Yoshikawa,”Glyoxalase I disruption and external carbonyl stress impair mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells and derived neurons”, Translational Psychiatry., 2021, doi: 10.1038/s41398-021-01392-w.
17	Cell:HSCs	Microscope	Y. Su, S. Lu, C. Hou, K. Ren, M. Wang, X. Liu, S. Zhao and X. Liu ,”Mitigation of liver fibrosis via hepatic stellate cells mitochondrial apoptosis induced by metformin”, International Immunopharmacology., 2022, doi: 10.1016/j.intimp.2022.108683.
18	Cell:HUVECs	Microscope	D. Ueno, K. Ikeda, E. Yamazaki, A. Katayama, R. Urata and S. Matoba ,”Spermidine improves angiogenic capacity of senescent endothelial cells, and enhances ischemia-induced neovascularization in aged mice”, Sci Rep., 2023, doi: 10.1038/s41598-023-35447-3.
19	Cell:KYSE30	Microscope	Q. Luo, X. Wu, P. Zhao, Y. Nan, W. Chang, X. Zhu, D. Su and Z. Liu,”OTUD1 activates caspase‐independent and caspase‐dependent apoptosis by promoting AIF nuclear translocation and MCL1 degradation”, Adv Sci (Weinh)., 2021, doi: 10.1002/advs.202002874.
20	Cell: Macrophage	Microscope	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
21	Cell:MDA-MB-415, MCF-7	Microscope	S.Y. Park, K.J. Jeong, A. Poire, D. Zhang, Y.H. Tsang, A.S. Blucher and G.B. Mills ,”Irreversible HER2 inhibitors overcome resistance to the RSL3 ferroptosis inducer in non-HER2 amplified luminal breast cancer”, Cell Death & Disease., 2023, doi: 10.1038/s41419-023-06042-1.
22	Cell:MIN6	Plate reader/Microscope	N. Mizusawa, N. Harada, T. Iwata, I. Ohigashi, M. Itakura and K. Yoshimoto,”Identification of protease serine S1 family member 53 as a mitochondrial protein in murine islet beta cells”, Islets., 2022, doi: 10.1080/19382014.2021.1982325.
23	Cell:MSCs	Flow Cytometer	S.Y. Jo, H.J. Cho and T.M. Kim,”Fenoldopam mesylate enhances the survival of mesenchymal stem cells under oxidative stress and increases the therapeutic function in acute kidney injury”, Cell Transplant., 2023, doi: 10.1177/09636897221147920.
24	Cell:Neuro-2A	Microscope、Plate reader	Y. Wang, Y. Shinoda, A. Cheng, I. Kawahata and K. Fukunaga,”Epidermal fatty acid-binding protein 5 (FABP5) Involvement in alpha-synuclein-induced mitochondrial injury under oxidative stress”, Biomedicines., 2021, doi: 10.3390/biomedicines9020110.
25	Cell:Neuron	Microscope	I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
26	Cell:Neuron	Microscope	A. Fukuda, S. Nakashima,Y. Oda, K. Nishimura, H. Kawashima, H. Kimura, T. Ohgita, E. Kawashita, K. Ishihara, A. Hanaki, M. Okazaki, E. Matsuda, Y. Tanaka, S. Nakamura, T. Matsumoto, S. Akiba, H. Saito, H. Matsuda and K. Takata,”Plantainoside B in Bacopa monniera Binds to Aβ Aggregates Attenuating Neuronal Damage and Memory Deficits Induced by Aβ”, Biol Pharm Bull., 2023, doi: 10.1248/bpb.b22-00797.
27	Cell:PAECs	Plate reader	T. Sakai, H. Takagaki, N. Yamagiwa, M. Ui, S. Hatta and J. Imai,”Effects of the cytoplasm and mitochondrial specific hydroxyl radical scavengers TA293 and mitoTA293 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice”, Antioxidants (Basel)., 2021, doi: 10.3390/antiox10091398.
28	Cell:PANC-1	Plate reader	W.A. Naime, A. Kimishima, A. Setiawan, J.R. Fahim, M.A. Fouad, M.S. Kamel and M. Arai,”Mitochondrial Targeting in an Anti-Austerity Approach Involving Bioactive Metabolites Isolated from the Marine-Derived Fungus Aspergillus sp.”, Marine drugs., 2020, doi: 10.3390/md18110555.
29	Cell:PANC-1, MIAPaca-2	Microscope	T. Taniai, Y. Shirai,Y. Shimada, R. Hamura, M. Yanagaki, N. Takada, T. Horiuchi, K. Haruki, K. Furukawa, T. Uwagawa, K. Tsuboi, Y. Okamoto, S. Shimada, S. Tanaka, T. Ohashi and T. Ikegami,”Inhibition of acid ceramidase elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress in pancreatic cancer cells”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.15123.
30	Cell:PC	Flow Cytometer	R. Hamura, Y. Shirai,Y. Shimada, N. Saito, T. Taniai, T. Horiuchi, N. Takada, Y. Kanegae, T. Ikegami, T. Ohashi and K. Yanaga ,”Suppression of lysosomal acid alpha‐glucosidase impacts the modulation of transcription factor EB translocation in pancreatic cancer”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.14921.
31	Cell:Porcine oocytes	Microscope	W. Hu, Y. Zhang, D. Wang, T. Yang, J. Qi, Y. Zhang, H. Jiang, J Zhang, B. Sun and S. Liang,”Iron Overload-Induced Ferroptosis Impairs Porcine Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in vitro”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.673291.
32	Cell:Porcine oocytes	Microscope	Y. Xiao, B. Yuan, W. Hu, J. Qi, H. Jiang, B. Sun, J. Zhang and S. Liang,”Tributyltin Oxide Exposure During in vitro Maturation Disrupts Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in Pigs”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.683448.
33	Cell:RGC-5	Plate reader	Y. Aoyama, S. Inagaki, K. Aoshima, Y. Iwata, S. Nakamura, H. Hara and M. Shimazawa,”Involvement of endoplasmic reticulum stress in rotenone-induced leber hereditary optic neuropathy model and the discovery of new therapeutic agents”, J Pharmacol Sci . .,2021, doi: 10.1016/j.jphs.2021.07.003.
34	Cell:SAS,HSC-2	Plate reader	K. Yamana, J. Inoue, R. Yoshida, J. Sakata, H. Nakashima, H. Arita, S. Kawaguchi, S. Gohara, Y. Nagao, H. Takeshita, M. Maeshiro, R. Liu, Y. Matsuoka, M. Hirayama, K. Kawahara, M. Nagata, A. Hirosue, R. Toya, R. Murakami, Y. Kuwahara, M. Fukumoto and H. Nakayama,”Extracellular vesicles derived from radioresistant oral squamous cell carcinoma cells contribute to the acquisition of radioresistance via the miR‐503‐3p‐BAK axis”, J Extracell Vesicles., 2021, doi: 10.1002/jev2.12169.
35	Cell:SBC-3	Flow Cytometer	N. Takahashi, T. Iguchi, M. Kuroda, M. Mishima and Y. Mimaki,”Novel Oleanane-Type Triterpene Glycosides from the Saponaria officinalis L. Seeds and Apoptosis-Inducing Activity via Mitochondria”, Int J Mol Sci., 2022, doi: 10.3390/ijms23042047.
36	Cell:SH-SY5Y	Microscope	Q. Guo, I. Kawahata, A. Cheng, H. Wang, W. Jia, H. Yoshino and K. Fukunaga,”Fatty acid-binding proteins 3 and 5 are involved in the initiation of mitochondrial damage in ischemic neurons”, Redox Biology., 2023, doi: 10.1016/j.redox.2022.102547.
37	Cell:SiHa	Microscope	F.F. Gao, J.H. Quan, M.A. Lee, W. Ye, J.M. Yuk, G.H. Cha, I.W. Choi and Y.H. Lee,”Trichomonas vaginalis induces apoptosis via ROS and ER stress response through ER–mitochondria crosstalk in SiHa cells”, Parasites &vectors., 2021, doi: 10.1186/s13071-021-05098-2.
38	Cell:SU-DHL-2	Flow Cytometer	Q. Zhao, D. Jiang, X. Sun, Q. Mo, S. Chen, W. Chen, R. Gui and X. Ma,”Biomimetic nanotherapy: core–shell structured nanocomplexes based on the neutrophil membrane for targeted therapy of lymphoma”, J Nanobiotechnology., 2021, doi: 10.1186/s12951-021-00922-4.
39	Cell:THP-1	Microscope	W. Zheng, Z. Zhou, Y. Rui, R. Ye, F. Xia, F. Guo, X. Liu, J. Su, M. Lou, and X.F. Yu,”TRAF3 activates STING-mediated suppression of EV-A71 and target of viral evasion”, Signal Transduct Target Ther., 2023, doi: 10.1038/s41392-022-01287-2.
40	Cell:TSM15	In Cell Analyzer	M. Honda, F. Shimizu, R. Sato, Y. Mizukami, K. Watanabe, Y. Takeshita, T. Maeda, M. Koga and T. Kanda,”Jo-1 Antibodies From Myositis Induce Complement-Dependent Cytotoxicity and TREM-1 Upregulation in Muscle Endothelial Cells”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2023, doi: 10.1212/NXI.0000000000200116.
41	Cell:tumor	Flow Cytometer	H. Wang, X. Rong, G. Zhao, Y. Zhou, Y. Xiao, D. Ma, X. Jin, Y. Wu, Y. Yan, H. Yang, Y. Zhou, M. Qian, C. Niu, X. Hu, D.Q. Li, Q. Liu, Y. Wen, Y.Z. Jiang, C. Zhao and Z.M. Shao ,”The microbial metabolite trimethylamine N-oxide promotes antitumor immunity in triple-negative breast cancer”, Cell Metab., 2022, doi: 10.1016/j.cmet.2022.02.010.
42	Cell:TY10	In Cell Analyzer	F. Shimizu, R. Ogawa, Y. Mizukami, K. Watanabe, K. Hara, C. Kadono, T. Takahashi, T. Misu, Y. Takeshita, Y. Sano, M. Fujisawa, T. Maeda, I. Nakashima, K. Fujihara and T. Kanda,”GRP78 antibodies are associated with blood-brain barrier breakdown in anti–myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody–associated disorder”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2022, doi: 10.1212/NXI.0000000000001038.
43	Cell:U2OS, HeLa	Microscope	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25块板	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30块板	200 μl/孔
	96孔板	5块板	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

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线粒体膜电位检测试剂盒货号：MT13

发表于2024年9月23日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体膜电位检测试剂盒货号：MT13

线粒体膜电位检测试剂盒

MT-1 MitoMP Detection Kit

商品信息

运输条件：室温

特点：

● 固定后仍可检测

● 荧光滞留性强

● 灵敏度高

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线粒体检测方案

产品解说

产品概述

产品特点

与各种试剂的比较

实验例

常见问题Q&A

参考文献

产品解说

产品概述

线粒体利用氧气合成ATP，从而产生细胞所需的能量，是重要的细胞器之一。线粒体活性低下和机能障碍与癌症、老化、阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病密切相关。因此，线粒体膜电位（MMP）作为线粒体相关疾病的一个有希望的靶点已被广泛研究。

产品特点

解决传统试剂的三个问题

观察线粒体膜电位时，使用JC-1、TMRE、TMRM，但由于PFA不可固定、容易淬灭，数据的再现性等问题。MT-1 MitoMP Detection Kit是克服了这些问题的线粒体膜电位的检测试剂。

并且，通过本试剂盒中包含的Imaging Buffer，可以在抑制了荧光背景和对细胞的损伤的状态下进行观察。

①固定后也可检测

由于微小的细胞状态的变化，也会造成线粒体膜电位发生变化，所以取得数据的重现性需要特别注意。通用的线粒体膜电位检测试剂（JC-1、TMRE）如果对细胞进行固定处理的话会失去荧光，所以需要使用活细胞进行迅速的测定。MT-1即使进行染色后进行PFA固定操作，也能保持荧光，因此可以进行高重复性的实验。

②可监控

没有进行药物刺激的细胞通过各种试剂染色，确认了荧光强度的变化。结果，JC-1和TMRE在染色后约10分钟左右荧光强度下降，MT-1仍保持了一定的荧光强度

③高灵敏度

线粒体膜电位的细微变化在JC-1中有难以检测的情况，在这种情况下，使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）监测MMP。MT-1可提供与TMRE同等的检测灵敏度。

微信截图_20211125095556.png

与各种试剂的比较

	Features	Sensitivity	Fixation	Monitoring	Fluorescence change (upon loss of mitochondrial membrane potential)	Detection (ex/em)
JC-1 (JC-1 MitoMP Detection Kit)	Recomended for starting-up	✓			Color change from red to green	Green: 450-490 nm / 500-550 nm Red: 530-560 nm / 570-640 nm
MT-1 (MT-1 MitoMP Detection Kit)	Recommended for more detailed analysis	✓ (High)	✓	✓	Decrease in fluorescence intensity	530-560 nm / 570-640 nm
TMRE	Widely used	✓ (High)			Decrease in fluorescence intensity	530-560 nm / 570-640 nm

实验例

1.通过去极化的实验例

通过线粒体去极化剂的cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)处理HeLa细胞，用该试剂观察膜电位的变化。

结果，确认了FCCP处理的细胞线粒体膜电位下降的情况。

2.凋亡诱导细胞线粒体膜电位的变化

预先在MT-1中染色的HL60细胞中添加Etoposide，诱导凋亡后，与Annexin V、FITC Conjugate一同染色，并通过流式细胞仪检测。

结果发现Annexin V-FITC产生的荧光强度变化（绿色荧光强度的增加）确认了凋亡的发生，以及从MT-1产生的荧光强度变化（红色荧光强度的降低）发现了线粒体膜电位的变化。

3.同时评估线粒体超氧化物和膜电位

用 HBSS 冲洗 HeLa 细胞后，用 MT-1 线粒体氧化酶检测试剂盒和线粒体超氧化物检测染料（(mtSOX Deep Red： MT14）共同染色，同时观察线粒体 ROS 和膜电位的产生情况。因此，线粒体膜电位的降低和线粒体 ROS 的产生是同时观察到的。

＜成像条件＞（共聚焦显微镜）

MT-1: Ex=561, Em=560-600 nm
mtSOX: Ex=633 nm, Em=640-700 nm

Scale bar: 10 μm

＜检测条件＞（酶标仪）Tecan，Infinite M200 Pro

MT-1: Ex=540-550 nm, Em=590-610 nm (Gain=200)
mtSOX: Ex=545-555 nm, Em = 665-685 nm

常见问题Q&A

Q1:使用荧光显微镜检测时需要注意什么？

A1:请尽量减少激发光照射时间并提高检测灵敏度。

细胞长期暴露于激发光内可能导致细胞损伤和荧光染料降解，请优化检测时间。

Q2：MT-1检测后可以固定吗？

A2：应使用4%多聚甲醛（PFA）固定，且不能与（Triton X-100、NP-40等）一起使用，因为这可能导致染泄漏。

Q3：固定后可以对细胞染色吗？

A3：由于MT-1在线粒体中的积累取决于线粒体膜电位，因此固定后不适用于染色。

Q4：是否需要做阳性对照？

A4：作为阳性对照，可在技术手册中找到使用FCCP（羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙）的实验例。

Q5：优化染色条件时，应使用何种浓度的MT-1染料

A5：MT-1染料的浓度建议稀释1000倍。但在优化染色条件时，请参考以下内容。

<荧光强度弱>

请优化以下浓度：稀释500-1000倍。

<观察到非特异性吸附>

请优化以下浓度：稀释1000至2000倍。

Q6:我可以使用缓冲液来制备MT-1工作溶液吗？

A6:可以使用Hanks的HEPES和HBSS。也可以使用MEM、RPMI和含10%FBS的MEM制备。

Q7：添加MT-1工作液后，可以不清洗直接上机检测吗？

A7：染色后，无需清洗即可观察样品。但我们不建议在不清洗的情况下长期观察它们，因为它们可能具有细胞毒性。

我们建议去除上清液并用培养基替换。

Q8：MT-1染色后，是否可以用PBS代替HBSS来清洗？

A8：我们建议使用HBSS来减少细胞损伤。如果您没有HBSS，我们建议使用培养基来代替清洗。

参考文献

No.	Sample	Instrument	Reference
1	STHdh Cells	Microscope	N. Okada, T. Yako, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Hara, “Reduced mitochondrial complex II activity enhances cell death via intracellular reactive oxygen species in STHdhQ111 striatal neurons Q1 with mutant huntingtin”, J. Pharmacol. Sci., 2021, doi:10.1016/j.jphs.2021.09.001.
2	Panc-1 Cells	Microscope	N. Okuni, Y. Honma, T. Urano, K. Tamura, “Romidepsin and tamoxifen cooperatively induce senescence of pancreatic cancer cells through downregulation of FOXM1 expression and induction of reactive oxygen species/lipid peroxidation”, Mol. Biol. Rep., 2022, doi:10.1007/s11033-022-07192-9.
3	BM Cells	Microscope	Y. Aoyagi, Y. Hayashi, Y. Harada, K. Choi, N. Matsumura, D. Sadato, Y. Maemoto, A. Ito, S. Yanagi, D. Starczynowski, H. Harada, “Mitochondrial Fragmentation Triggers Ineffective Hematopoiesis in Myelodysplastic Syndromes”, Cancer Discovery, 2022, doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0032.
4	Flies indirect flight muscle Cells	Microscope	N. Nozawa, M. Noguchi, K. Shinno, M. Tajima, S. Aizawa, T. Saito, A. Asada, T. Ishii, M. Ishizuka, K. Iijima and K. Ando, “5-Aminolevulinic acid and sodium ferrous citrate ameliorate muscle aging and extend healthspan in Drosophila”, FEBS Open Bio, 2022, doi:10.1002/2211-5463.13338.
5	HBME Cells	Microscope	Y. Sakai, M. Taguchi, Y. Morikawa, H. Miyazono, K. Suenami, Y. Ochiai, E. Yanase, T. Takayama, A. Ikari, T. Matsunaga, “Apoptotic mechanism in human brain microvascular endothelial cells triggered by 40-iodo-α-pyrrolidinononanophenone: Contribution of decrease in antioxidant properties”, Toxicol. Lett., 2022, doi:10.1016/j.toxlet.2021.11.018.
6	MIN6-M9 Cells	Microscope	R. Inoe, T. Tsuno, Y. Togashi, T. Okuyama, A. Sato, K. Nishiyama, M. Kyohara, J. Li, S. Fukushima, T. Kin, D. Miyashita, Y. Shiba, Y. Atobe, H. Kiyonari, K. Bando, A. S. Shapiro, K. Funakoshi, R. N. Kulkarni, Y. Terauchi, and J. Shirakawa, “Uncoupling protein 2 and aldolase B impact insulin release by modulating mitochondrial function and Ca2+ release from the ER”, 2022, iScience, doi:10.1016/j.isci.2022.104603.
7	SH-SY5Y Cells	Flow Cytometer	M. Hashimoto, M. Fujimoto, K. Konno, M. L. Lee, Y. Yamada, K. Yamashita, C. Toda, M. Tomura, M. Watanabe, O. Inanami and H. Kitamura, “Ubiquitin-Specific Protease 2 in the Ventromedial Hypothalamus Modifies Blood Glucose Levels by Controlling Sympathetic Nervous Activation”, J. Neurosci., 2022, doi:10.1523/JNEUROSCI.2504-21.2022.
8	Fibroblasts, ciBAs	Microscope	Y. Takeda and P. Dai, “Chronic Fatty Acid Depletion Induces Uncoupling Protein 1 (UCP1) Expression to Coordinate Mitochondrial Inducible Proton Leak in a Human-Brown-Adipocyte Model”, 2022, doi:10.3390/cells11132038.
9	Sperm cells from C. osakensis queens	Microscope	A. Gotoh, M. Takeshima and K Mizutani, “Near-anoxia induces immobilization and sustains viability of sperm stored in ant queens”, Sci. Rep., 2023, doi:10.1038/s41598-023-29705-7.
10	Nucleus Pulposus Cells	Microscope	K. Suyama, D. Sakai, S. Hayashi, N. Qu, H. Terayama, D. Kiyoshima, K. Nagahori and M. Watanabe, “Bag-1 Protects Nucleus Pulposus Cells from Oxidative Stress by Interacting with HSP70”, Biomedicines, 2023, doi:10.3390/biomedicines11030863.
11	HL60 Cells, KG1a Cells	Flow Cytometer	K. Kamachi, H. Ureshino, T. Watanabe, N. Y. Sakai, Y. F. Kurahashi, K. Kawasoe, T. Hoshiko, Y. Yamamoto, Y. Kurahashi, and S. Kimura , “Combination of a New Oral Demethylating Agent, OR2100, and Venetoclax for Treatment of Acute Myeloid Leukemia”, Cancer Res Commun., 2023, doi:10.1158/2767-9764.CRC-22-0259.
12	RAW264 Cells	Microscope	H. Gu, Y. Zhu, J. Yang, R. Jiang, Y. Deng, A. Li, Y. Fang, Q. Wu, H. Tu, H. Chang, J. Wen and X. Jiang, “Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration”, Adv sci, 2023, doi:10.1002/advs.202302136.

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MitoBright LT Green试剂货号：MT10

发表于2024年9月20日由上海金畔生物科技有限公司

MitoBright LT Green试剂货号：MT10

线粒体长效荧光探针-绿色

MitoBright LT Green

商品信息

储存条件：-20度保存

运输条件：室温

特点：

● 荧光持续时间长

● 可在含血清培养基中染色

● 荧光显微镜、流式细胞仪均可检测

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产品文献

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选择规格：

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现货

荧光长时间存在

可使用含血清培养基

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产品概述

产品特点

实验例

产品文献

荧光特性

常见问题Q&A

规格性状

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产品概述

细胞内有各种各样的细胞器，承担着各种各样必须的生命活动。其中线粒体不仅是通过氧化磷酸化反应生成ATP的场所，它还与癌症、细胞衰老、阿尔兹海默症、帕金森综合症等神经退行性疾病紧密相关，因此它是细胞内最重要的细胞器之一。

在对线粒体的形态和动态进行观察以及定量检测时，通常使用小分子荧光探针标记和荧光蛋白的基因转染两种方法。荧光蛋白的基因转染存在转染效率不稳定等情况，因此操作简便的小分子荧光探针的使用更为广泛。现在市面上销售的小分子荧光探针中，多为含有氯甲基的探针，该探针存在观察时间短，染色时不能使用含血清的培养基，染色后荧光背景高等问题。MitoBright LT荧光探针克服了这些问题，可在线粒体内稳定存在一天以上，条件合适的情况下可达到一周。而且与含有氯甲基的探针相比，染色后的荧光强度更高。本品直接采用DMSO溶液包装，可快速方便的进行线粒体染色。荧光颜色有Green, Red, Deep Red等多种选择，可满足多重染色等各种各样的实验要求。

产品特点

1.可长时间在细胞内存在

用HBSS清洗HeLa细胞后，分别用MitoBright LT和其他公司的试剂进行染色，更换含血清的培养基，培养4天后观察线粒体染色情况。其他公司的染色试剂在4天后荧光强度大幅降低，而MitoBright LT依然维持着高荧光强度，并且在染色7日后依然可以观察到荧光。

＜检测条件＞

MitoBright LT Green 、（T公司）Green：Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red 、（T公司）Red：Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red 、（T公司）Deep Red：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

2.可以使用含血清培养基

用MitoBright LT和其他公司试剂，分别用含有血清和不含血清的培养基染色。其他公司试剂在含有血清的培养基染色时，荧光明显减弱，而MitoBright LT在含有血清的培养基条件下，荧光没有减弱，可明显观察到线粒体的染色情况。

实验例

实时荧光观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

用流式细胞仪检测

1. 用RPMI培养基(10% Fetal Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin)配制Jurkat细胞悬液(3.2×10⁵cell/ml)接种于5 cm培养皿中，在37℃，5% CO₂培养箱内过夜培养。

2. 去除培养基，加入MitoBright LT Working Solution (0.1 μmol/l, 5 ml)，在37℃培养30分钟。

3. 去除溶液，用 5 ml的PRPMI培养基清洗细胞2 次。

4. 更换RPMI培养基，持续培养细胞，每隔2 天用流式细胞仪检测。

MitoBright LT Green MitoBright LT Red MitoBright LT Deep Red

Excitation: 488 nm Excitation: 488 nm Excitation: 633 nm

Emission: 515-545 nm Emission: 564-604 nm Emission: 650-670 nm

在胶原蛋白涂覆玻璃板上观察线粒体荧光成像

胶原蛋白涂覆玻璃板通常用于线粒体形态的高倍放大观察。

现有的线粒体染色试剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以在不受背景影响的情况下清楚地对线粒体进行染色。

<染色条件>

将HeLa细胞接种在胶原蛋白涂覆玻璃板上，培养24小时，提取上清液并用HBSS洗涤。

加入100 nmol/l的MitoBright LT Green工作溶液，培养30分钟后，提取上清液并用HBSS洗涤后用荧光显微镜观察。

<检测条件>

Ex 488 nm，Em 500-560 nm

<结果>

现有的线粒体染色剂存在吸附胶原蛋白和升高背景的问题，但是MitoBright LT系列可以清晰地对线粒体染色，而不受背景影响。

通过超分辨率激光显微镜（STED）观察线粒体内部构造

线粒体疾病致突变的Cybrid细胞用MitoBright-LT-Deep Red染色，用超分辨激光显微镜(STED)观察，证实线粒体嵴结构异常。

＜实验条件＞

色素：MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）

仪器：Leica超分辨率激光显微镜TCS SP8 STED 3X

Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm

STED激光：775nm

<实验步骤>

1将细胞接种在玻璃培养皿中，培养2天（37℃，5% CO₂）。

2去除培养基后，加入使用L-15培养基（含10%FBS）制备的MitoBrightLT Deep Red（100 nmol/l）工作液。

3孵育45分钟（37度，5% CO₂）。

4去除上清液，用HBSS清洗两次。

5加入L-15培养基（含10%FBS），通过超分辨率激光显微镜（Leica TCS SP8 STED）进行观察。

以上数据由东京都老年学研究所衰老控制研究小组的大澤郁朗博士和藤田泰典博士友情提供。

产品文献

同仁化学研究所开发的线粒体长效染色荧光探针MitoBright LT系列在世界范围内广受科研人员的好评。在上市后的很短时间内，就出现了多篇使用MitoBright LT系列探针的论文，下面收集整理了部分的论文，其中红色字体标记的是使用本产品标记线粒体后，长时间(最长至5天)观察线粒体动态的报道，供感兴趣的科研人员参考。

产品名	检测样品	染色后的观察时间	检测仪器	发表期刊(含原文链接)	影响因子
MitoBright LT Green	细胞 (U251)	立即	荧光显微镜	Pharmaceuticals	4.286
MitoBright LT Green	酵母 (Lipomyces starkeyi)	立即	荧光显微镜	Genes to Cells	1.655
MitoBright LT Green	细胞 (HeLa)	立即	荧光酶标仪	Biomaterials	10.317
MitoBright LT Green	细胞 (Naive CD4+ T cells)	立即	荧光显微镜	Cell Reports	9.423
MitoBright LT Green	细胞 (CT26)	立即	流式细胞仪	Journal of Radiation Research	2.841
MitoBright LT Green	细胞 (C2C12)	5 天	荧光显微镜	Polymers	4.329
MitoBright LT Green	细胞 (BMM)	36 小时 or 3 天	荧光显微镜/ 流式细胞仪	JCI Insights	8.315
MitoBright LT Green	细胞 (mouse erythrocytes)	立即	荧光显微镜	Front. Cell. Infect. Microbiol.	5.293
MitoBright LT Red	细胞 (SH-SY5Y)	立即	荧光显微镜	Free Radical Biol. Med.	7.376
MitoBright LT Red	细胞 (MRC-5)	立即	荧光显微镜	The FEBS Journal	5.542
MitoBright LT Red	细胞 (A11 cells/ P29 cells)	3 天	荧光显微镜	BMC Mol. Cell Biol.	5.293
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7; HCT-116 )	立即	荧光显微镜	Small	13.281
MitoBright LT Deep Red	细胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 )	8 小时	荧光显微镜	Advanced Therapeutics	–
MitoBright LT Deep Red	细胞 (4T1)	24 小时	荧光显微镜	Advanced Functional Materials	18.808
MitoBright LT Deep Red	细胞 (SW982)	立即	荧光显微镜	Gene	3.368

荧光特性

MitoBright LT 染料的荧光特性

常见问题Q&A

Q1：MitoBright LT需要用DMSO溶液配制，反复冻结融化也不会影响试剂质量吗？

A1：我们已经确认可以使用冻融30次的溶液进行染色。

Q2：MitoBright LT和MitoBright的区别。

A2：MitoBright LT是MitoBright具有更强细胞内滞留性性能的产品。另外MitoBright LT是溶于DMSO的产品，可以立即使用，而无需准备染色溶液。

Q3：用MitoBright LT系列染色后再去极化是否会影响染色效果？

A3：我们确认了去极化和细胞种类对于染色效果的影响，MitoBright LT的每种染料都有不同程度的影响。作为参考，本公司将HeLa细胞用不同的MitoBrightLT试剂进行染色，在以下条件下进行去极化处理，观察荧光染色的变化。

<染色条件>

HeLa细胞用MitoBright LT（100 μmol/l，孵育30分钟）染色，并用HBSS洗涤。

用FCCP（100 μmol/l，孵育60分钟）处理，用HBSS洗涤2次，然后观察荧光。

<检测条件>

MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm

MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm

MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

规格性状

性状：本品是黄色液体

吸光度：0.600～0.800(490 nm附近）

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线粒体染色线粒体损伤线粒体自噬线粒体氧化应激线粒体呼吸

发表于2024年9月19日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体

线粒体(mitochondrion) 是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。最近越老越多的研究发现线粒体在细胞中的作用远远不止”细胞能量站”。它们参与了各种细胞功能调控，与很多人类疾病存在着莫大的联系。包括细胞信号传导、代谢、自噬、衰老和肿瘤发生都与线粒体的质量和活性相关

线粒体染色

线粒体损伤

线粒体自噬

线粒体氧化应激

线粒体呼吸

品名货号用途

MitoBright IM Red for Immunostaining试剂	MT15	免疫荧光用线粒体荧光染料Red
MitoBright LT Green试剂	MT10	线粒体长效荧光染色（绿色）
MitoBright LT Red试剂	MT11	线粒体长效荧光染色（红色）
MitoBright LT Deep Red试剂	MT12	线粒体长效荧光染色（深红色）

线粒体膜电位检测试剂盒	MT13	线粒体膜电位检测
线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit	MT09	线粒体膜电位检测
Cellstain- MitoRed试剂	R237	线粒体ATP检测-红色

Mtphagy Dye试剂	MT02	线粒体自噬
线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit	MD01	线粒体自噬检测

mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection	MT14	线粒体超氧化物检测
铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen	M489	线粒体内二价铁离子检测
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂	MT05	线粒体内单线态氧检测
MitoPeDPP试剂	M466	线粒体内脂质过氧化物检测

ADP/ATP比率检测试剂盒—ADP/ATP Ratio Assay Kit-Luminescence	A552	检测细胞中ADP与ATP的比率
Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒	E297	氧消耗量检测
Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒	CK18	ATP活性检测
Glutamine Assay Kit-WST试剂盒	G268	谷氨酰胺的定量检测
Glutamate Assay Kit-WST试剂盒	G269	谷氨酸的定量检测
NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒	N509	NAD/NADH检测试剂盒
NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒	N510	NADP/NADPH检测
α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric	K261	对细胞内的α-KG进行定量检测

线粒体功能研究

▶ 线粒体呼吸指标一览表

▶ 线粒体染色选择指南

▶ 线粒体自噬检测

▶ 线粒体膜电位选择指南

▶ 代谢相关检测

▶ 癌症关联检测

▶ 脂质过氧化物积累与细胞衰老、线粒体之间的联系

线粒体质量控制途径

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线粒体简要通路图

同仁化学线粒体简要通路图.pdf

线粒体相关检测指标

线粒体自噬检测

线粒体自噬
试剂	Mtphagy Dye	Keima-Red
原理	线粒体自噬染料是一种PH敏感的荧光探针，该染料聚集在线粒体中，并由溶酶体的酸性条件而发出荧光	这是一种基于PH感应比值的荧光蛋白。该蛋白在溶酶体中具有比较高的荧光比值（如550 nm/440 nm）。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	>30 min	–
Ex/Em	530/700	440,550/620
产品货号	MD01 , MT02	–

线粒体自噬Mitophagy试剂盒【MD01】无需蛋白质表达/转染。添加试剂即可轻松检测线粒体自噬。

线粒体膜电位检测

Membrane potential 线粒体膜电位
试剂	JC-1	MT-1	TMRM, TMRE
原理	JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。	由于膜电位，细胞渗透性荧光染料在完整的线粒体中积累。MT-1具有极强的光稳定性，比JC-1更灵敏，可以提供与TMRE相当的检测灵敏度。	该试剂是细胞渗透性荧光染料，由于膜电位在完整的线粒体中积累。探针扩散发生在膜电位降低的受损线粒体中。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	Yes	–
染色时间	10- 60 min	30 min	30- 60 min
Ex/Em	Monomer:514/529 J-aggregation: 585/590	530-560 / 570-640	550/575
产品货号	MT09	MT13	–

JC-1、TMRE和TMRM广泛用于监测线粒体膜电位。然而，这些染料具有局限性，例如光稳定性低和醛固定后的保留性差。这些限制导致实验再现性差。

MT-1 MitoMP检测试剂盒具有高光稳定性，即使在染色后用多聚甲醛固定的细胞中。这些特征使得MT-1试剂盒能够产生高度可重复的结果。

此外，该试剂盒中包含的成像缓冲液使背景荧光最小化，并在进行测定时保持细胞活力。

线粒体金属离子检测

	Iron ion (Fe²⁺) 亚铁离子	Calcium ion (Ca²⁺) 钙离子
试剂	Mito-FerroGreen	Rhod 2-AM
原理	该试剂是一种细胞通透性探针，其积累在线粒体中，并与线粒体中的亚铁离子发生特异性反应，发出绿色荧光。	该试剂是一种细胞通透性探针，该探针积聚在线粒体中，并与线粒体中的钙离子发生特异性反应，发出红色荧光。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	30 min	30-60 min
Ex/Em	505/535	553/576
产品货号	M489	R002

线粒体荧光染色

Mitochondria staining 线粒体染色
试剂	MitoBright LT series	MitoBright IM Red	MitoTracker series
原理	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。	细胞渗透性荧光染料，由于膜电位而聚集在完整的线粒体中，并与蛋白质和其他生物分子共价结合。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	Yes	–
染色时间	>10 min	30 min	15 -45 min
Ex/Em	493/508,547/563, 643/663	548/566	490/516~644/665
产品货号	MT10、MT11、MT12	MT15	–

在HeLa细胞中4天后，MitoBright LT仍被证实保留在线粒体中。

线粒体

发表于2024年7月24日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体

线粒体损伤

线粒体自噬

线粒体氧化应激

线粒体染色

品名	货号	用途
线粒体膜电位检测试剂盒	MT13	线粒体膜电位检测
线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit	MT09	线粒体膜电位检测
Cellstain- MitoRed试剂	R237	线粒体ATP检测-红色
Cellstain- Rh123试剂(罗丹明123）	R233	线粒体ATP检测-绿色

品名	货号	用途
Mtphagy Dye试剂	MT02	线粒体自噬
线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit	MD01	线粒体自噬检测

品名	货号	用途
mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection	MT14	线粒体超氧化物检测
铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen	M489	线粒体内二价铁离子检测
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂	MT05	线粒体内单线态氧检测
MitoPeDPP试剂	M466	线粒体内脂质过氧化物检测

品名	货号	用途
MitoBright IM Red for Immunostaining试剂	MT15	免疫荧光用线粒体荧光染料Red
MitoBright LT Green试剂	MT10	线粒体长效荧光染色（绿色）
MitoBright LT Red试剂	MT11	线粒体长效荧光染色（红色）
MitoBright LT Deep Red试剂	MT12	线粒体长效荧光染色（深红色）

线粒体功能研究

线粒体简要通路图海报下载

同仁化学线粒体简要通路图.pdf

线粒体相关检测试剂

线粒体自噬检测

线粒体自噬
试剂	Mtphagy Dye	Keima-Red
原理	线粒体自噬染料是一种PH敏感的荧光探针，该染料聚集在线粒体中，并由溶酶体的酸性条件而发出荧光	这是一种基于PH感应比值的荧光蛋白。该蛋白在溶酶体中具有比较高的荧光比值（如550 nm/440 nm）。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	>30 min	–
Ex/Em	530/700	440,550/620
产品货号	MD01 , MT02	–

线粒体膜电位检测

Membrane potential 线粒体膜电位
试剂	JC-1	TMRM, TMRE
原理	JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。	该试剂是细胞渗透性荧光染料，由于膜电位在完整的线粒体中积累。探针扩散发生在膜电位降低的受损线粒体中。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	10- 60 min	30- 60 min
Ex/Em	Monomer:514/529	550/575
Ex/Em	J-aggregation: 585/590
产品货号	MT09	–

线粒体金属离子检测

	Iron ion (Fe²⁺) 亚铁离子	Calcium ion (Ca²⁺) 钙离子
试剂	Mito-FerroGreen	Rhod 2-AM
原理	该试剂是一种细胞通透性探针，其积累在线粒体中，并与线粒体中的亚铁离子发生特异性反应，发出绿色荧光。	该试剂是一种细胞通透性探针，该探针积聚在线粒体中，并与线粒体中的钙离子发生特异性反应，发出红色荧光。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	30 min	30-60 min
Ex/Em	505/535	553/576
产品货号	M489	R002

线粒体荧光染色

Mitochondria staining 线粒体染色
试剂	MitoBright LT series	MitoTracker series
原理	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	>10 min	15 -45 min
Ex/Em	493/508,547/563, 643/663	490/516~644/665
产品货号	MT10、MT11、MT12	–

Mitochondria staining 线粒体染色
试剂	DsRed	MitoRed	Rh123
原理	一种红色荧光蛋白染料，通过转染试剂与完整的线粒体结合。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–	–
染色时间	Expression in 8 -12 hrs.	>15 min	>15 min
Ex/Em	558/583	560/580	507/529
产品货号	–	R237	R233

线粒体氧化应激

	Lipophilic peroxide 脂质过氧化物	Singlet oxygen 单线态氧	Superoxide 超氧化物
试剂	MitoPeDPP	Si-DMA	MitoSOX
原理	MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。	该试剂是一种细胞渗透性荧光探针，积聚在线粒体中，与线粒体中产生的单线态氧发生反应，发出红色荧光。	该试剂是一种细胞渗透荧光探针，积聚在线粒体中，与线粒体中产生的超氧化物反应，发出红色荧光。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–	–
染色时间	> 15 min	> 45 min	> 10 min
Ex/Em	452/ 470	644/ 670	510/ 590
产品货号	M466	MT05	–

引用论文

① H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, N. Saitoh, S. Hino and M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Reports, 2017, 18(9), 2148.
② L. Garcia-Prat, M. Martinez-Vicente and P. Munoz-Canoves, “Autophagy: a decisive process for stemness”, Oncotarget, 2016, 7(11), 12286.
③ M. Bitar, S. Abdel-Halim and F. Al-Mulla, “Caveolin-1/PTRF upregulation constitutes a mechanism for mediating p53-induced cellular senescence: implications for evidence-based therapy of delayed wound healing in diabetes”, Am J Physiol Endocrinol Metab., 2013, 305(8), E951.
④ C. Wiley, M. Velarde, P. Lecot, A. Gerencser, E. Verdin, J. Campisi, et. al., “Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype”, Cell Metab., 2016, 23(2), 303.
⑤ E. Liao, Y. Hsu, Q. Chuah, Y. Lee, J. Hu, T. Huang, P-M Yang & S-J Chiu, “Radiation induces senescence and a bystander effect through metabolic alterations.”, Cell Death Dis., 2014, 5, e1255.
⑥ K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, A. Murayama, J. Yanagisawa and K. Kimura, “Perturbation of Ribosome Biogenesis Drives Cells into Senescence through 5S RNP-Mediated p53 Activation”, Cell Rep. 2015, 10(8), 1310.
⑦ M. J. Son, Y. Kwon, T. Son and Y. S. Cho, “Restoration of Mitochondrial NAD+ Levels Delays Stem Cell Senescence and Facilitates Reprogramming of Aged Somatic Cells”, Stem Cells. 2016, 34(12), 2840.

Mtphagy Dye试剂货号：MT02

发表于2024年7月7日由上海金畔生物科技有限公司

Mtphagy Dye试剂货号：MT02

Mtphagy Dye

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光防潮，充氮气

运输条件：室温

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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选择规格：

5μg*3

价格：

线粒体自噬

注意事项

性质

检测原理

参考文献

规格性状

注意事项

如需检测线粒体自噬，可查看Mitophagy Detection Kit

如您是首次使用Mtphagy染料，建议使用以上试剂盒（内含溶酶体），使用线粒体自噬染料与溶酶体染料共染进行检测

性质

　　线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

首次使用Mtphagy染料时，建议使用包含溶酶体染色试剂（Lyso Dye）的线粒体自噬检测试剂盒（产品货号：MD01），与溶酶体共染色来检测线粒体自噬。

开发者： Dojindo Molecular Technologies, Inc.

检测原理

Mtphagy染料的线粒体自噬检测机制

有关使用Mtphagy染料的实验数据，请参见线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit（产品货号MD01）

参考文献

1) J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2) K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3) E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4) H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5) Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6) K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

规格性状

规格性状：

该产品为紫色至品红色固体。

NMR光谱：测试一致

处理条件

1.保存方法：冷藏，遮光，2.氮气填充，请注意吸潮

关联产品

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit

线粒体自噬检测试剂盒

DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

DALGreen – 细胞自噬荧光探针

DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

DAPGreen – 细胞自噬荧光探针

DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

细胞自噬检测试剂盒

LysoPrime Green – High Specificity and pH Resistance

溶酶体染色试剂Green

Mtphagy Dye试剂货号：MT02

发表于2024年7月7日由上海金畔生物科技有限公司

Mtphagy Dye试剂货号：MT02

Mtphagy Dye

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光防潮，充氮气

运输条件：室温

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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选择规格：

5μg*3

期货

线粒体自噬

注意事项

性质

检测原理

参考文献

规格性状

注意事项

如需检测线粒体自噬，可查看Mitophagy Detection Kit

如您是首次使用Mtphagy染料，建议使用以上试剂盒（内含溶酶体），使用线粒体自噬染料与溶酶体染料共染进行检测

性质

首次使用Mtphagy染料时，建议使用包含溶酶体染色试剂（Lyso Dye）的线粒体自噬检测试剂盒（产品货号：MD01），与溶酶体共染色来检测线粒体自噬。

开发者： Dojindo Molecular Technologies, Inc.

检测原理

Mtphagy染料的线粒体自噬检测机制

有关使用Mtphagy染料的实验数据，请参见线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit（产品货号MD01）

参考文献

规格性状

规格性状：

该产品为紫色至品红色固体。

NMR光谱：测试一致

处理条件

1.保存方法：冷藏，遮光，2.氮气填充，请注意吸潮

关联产品

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit

线粒体自噬检测试剂盒

DALGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

DALGreen – 细胞自噬荧光探针

DAPGreen – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

DAPGreen – 细胞自噬荧光探针

DAPRed – Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂

细胞自噬检测试剂盒

LysoPrime Green – High Specificity and pH Resistance

溶酶体染色试剂Green

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

发表于2024年4月26日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

商品信息

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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产品文献

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现货

线粒体自噬检测

试剂盒内含

产品概述

原理

实验例

荧光特性

参考文献

常见问题Q&A

试剂盒内含

产品概述

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

发表于2024年4月26日由上海金畔生物科技有限公司

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

商品信息

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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选择规格：

1set

现货

线粒体自噬检测

试剂盒内含

产品概述

原理

实验例

荧光特性

参考文献

常见问题Q&A

试剂盒内含

产品概述

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

实验例

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

■线粒体膜电位检测

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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