特点：
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
NH2-reactive HiLyte FluorTM 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。
* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 647放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM647中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive HiLyte FluorTM647在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
| Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
| Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？ |
| A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。 |
| Q5:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
| 1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto, J.C.R. Jones and D. Tsuruta, “Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization via a macropinocytic pathway”, Am. J. Pathol.., 2013, 182, (3), 828. |
| 2) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y. Baba, M. Ohta, “Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products”, J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323. |
| 3) Y. Hayashi, M. Okutani, S. Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, “Generation of anti-porcine CD69 monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of cellular immunity by flow cytometric analysis”, Anim. Sci. J.., 2018, 89, (5), 825. |
| 4) T. Kojima, J. Hata, H. Oka, K. Hayashi, K. Hitomi and H. Nakano, “Spatial arrangement of proteins using scCro-tag: application for an in situ enzymatic microbead assay.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018, 82, (11), 1911. |
| 5) S. Mawaribuchi, Y. Haramoto, H. Tateno, Y. Onuma, Y. Aiki and Y. Ito, “rBC2LCN lectin as a potential probe of early-stage HER2-positive breast carcinoma.”, FEBS Open Bio., 2020, DOI: 10.1002/2211-5463.12852. |
