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HiLyte Fluor 647 Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK15 HiLyte Fluor 647标记试剂盒-氨基

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HiLyte Fluor 647 Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK15
HiLyte Fluor 647标记试剂盒-氨基
HiLyte Fluor 647 Labeling Kit – NH2
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

 

● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

● 可以标记50至200μg的蛋白质。

● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

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选择规格：
3samples
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蛋白抗体标记检测方案
试剂盒内含
产品概述
原理
荧光特性
操作步骤
产品优势
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

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产品概述

NH2-reactive HiLyte FluorTM 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。

* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标

原理

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荧光特性

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操作步骤

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 647放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）

（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM647中并用移液器吹打使其溶解。c）

（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）

（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。

（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。

（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。

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a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）NH2-reactive HiLyte FluorTM647在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。

d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液。

e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

产品优势

1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

常见问题Q&A

Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。
Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。
Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？
A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。
Q5:标记产物能保存多久？
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。

参考文献

1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto,   J.C.R. Jones and D. Tsuruta, “Bullous pemphigoid IgG induces BP180   internalization via a macropinocytic pathway”, Am. J. Pathol.., 2013,   182, (3), 828.
2) W. Jin, K. Yamada, M.   Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M.   Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y.   Baba, M. Ohta, “Application of IgY to sandwich enzyme-linked   immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for   detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy   products”, J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323.
3) Y. Hayashi, M. Okutani, S.   Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, “Generation of anti-porcine CD69   monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of   cellular immunity by flow cytometric analysis”, Anim. Sci. J.., 2018,   89, (5), 825.
4) T. Kojima, J. Hata, H.   Oka, K. Hayashi, K. Hitomi and H. Nakano, “Spatial arrangement of   proteins using scCro-tag: application for an in situ enzymatic microbead   assay.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018, 82, (11), 1911.
5) S. Mawaribuchi, Y.   Haramoto, H. Tateno, Y. Onuma, Y. Aiki and Y. Ito, “rBC2LCN lectin as a   potential probe of early-stage HER2-positive breast carcinoma.”, FEBS   Open Bio., 2020, DOI: 10.1002/2211-5463.12852.

HiLyte Fluor 555 Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK14 HiLyte Fluor 555标记试剂盒-氨基

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HiLyte Fluor 555 Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK14
HiLyte Fluor 555标记试剂盒-氨基
HiLyte Fluor 555 Labeling Kit – NH2
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

● 可以标记50至200μg的蛋白质。

● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

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试剂盒内含
产品概述
原理
荧光特性
操作步骤
产品优势
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

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产品概述

该试剂盒主要用于制备红色荧光标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和示踪用胞内蛋白。用NH2-reactive HiLyte FluorTM 555是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 555最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子与4-6个HiLyte FluorTM 555分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 555加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 555能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 555标记后的IgG的激发和发射波长分别为555nm和570nm。

* HiLyte FluorTM 为AnaSpec,Inc公司的商标

原理

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荧光特性

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操作步骤

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 555-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 555放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤：

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟。 b）

（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 555中并用移液器吹打使其溶解。c）

（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）

（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。

（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。

（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。

image.png

a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）NH2-reactive HiLyte FluorTM 555在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。

d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液。

e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

产品优势

1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

常见问题Q&A

Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。
Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。
Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？
A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时，标记比率是相同的。
Q5:标记产物能保存多久？
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。

参考文献

1)A. Nagao, K. Sato, K.M. Nishida, H.   Siomi, M.C. Siomi, “Gender-specific hierarchy in nuage   localization of PIWI-interacting RNA factors in Drosophila”, Front   Genet.,2011, 2, 55.
2) H. Hoshino, G. Shioi, S.   Aizawa, “AVE protein expression and visceral endoderm cell behavior   during anterior–posterior axis formation in mouse embryos: Asymmetry in OTX2   and DKK1 expression”, Dev. Biol.., 2015, 402, (2), 175.
3) T. Kaneko, T. Minohara, S.   Shima, K. Yoshida, A. Fukuda, N. Iwamori, T. Inai and H. Iida, “A   membrane protein, TMCO5A, has a close relationship with manchette   microtubules in rat spermatids during spermiogenesis”, Mol. Reprod.   Dev.., 2019, 86, (3), 330.
4) Y. Nakashima, T. Mima, M.   Yashiro, T. Sonou, M. Ohya, A. Masumoto, S. Yamanaka, D. Koreeda, K. Tatsuta,   Y. Hanba, M. Moribata, S. Negi, T. Shigematsu, “Expression and   localization of fibroblast growth factor (FGF) 23 and Klotho in the spleen:   its physiological and functional implications”, Growth Factors ., 2016,   34, (5-6), 196.
5) Z. Zhang, K. Kakutani, K.   Maeno, T. Takada, T. Yurube, M. Doita, M. Kurosaka and K. Nishida,   “Expression of silent mating type information regulator 2 homolog 1 and   its role in human intervertebral disc cell homeostasis”, Arthritis Res.   Ther.., 2011, 13, (6), R200.
6) I. Hasan, M. Gerdol, Y.   Fujii and Y. Ozeki, “Functional Characterization of OXYL, A SghC1qDC   LacNAc-specific Lectin from The Crinoid Feather Star Anneissia   Japonica.”, Mar Drugs., 2019, 17, DOI:10.3390/md17020136.
7)Y.   Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa,   S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H.  Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y.   Ozeki, “A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from   purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP   kinases.”, FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154.

Fluorescein Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK01 荧光素标记试剂盒-氨基

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Fluorescein Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK01
荧光素标记试剂盒-氨基
Fluorescein Labeling Kit – NH2
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特点：

● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

● 可以标记50至200μg的蛋白质。

● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

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NO.1.   Biotin Labeling Kit – NH2    生物素抗体标记试剂盒-氨基

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试剂盒内含

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产品概述

该试剂盒主要用于制备用荧光素标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和胞内蛋白示踪。氨基反应型荧光素是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，包括Storage buffer。每一管荧光素最多能够标记200μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个荧光素分子共价结合。该试剂盒还包含一个缓冲液交换系统，因此含有氨基缓冲液的样品也能用此试剂盒来标记。虽然用膜来过滤有时会导致IgG聚集，但是试剂盒中的缓冲液交换系统能够防止标记过程中聚集现象的发生。用该试剂盒标记的抗体在4℃下能够保存至少2个月。被荧光素标记后的IgG的激发和发射波长分别为495nm和520nm。

原理

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产品优势

1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。

荧光特性

1606795014967391.png

操作步骤

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者Fluorescein -IgG标记物始终存在于Filtration tube的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive fluorescein放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

1622194857617733.jpg

a) 样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5 min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c) NH2-Reactive Fluorescein Dye在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解，如果没有DMSO的话，可以用乙醇来替代。
d) 如果IgG的量为200μg，在步骤4时加入所有的NH2-Reactive Fluorescein Dye溶液。
e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

标记率计算

计算标记率：

1分子蛋白质上结合的荧光素的数量 (标记率) 的计算方法：将标记的蛋白质溶液用5倍的中性缓冲液稀释，分别测定在280nm和各个荧光染料的最大吸收波长处的吸光度，采用以下公式计算。

1606793275868948.png

* 如果是IgG，摩尔吸光系数ε=216,000。

* 荧光染料在WS缓冲液中的摩尔吸光系数参见下表：

1606793326312471.png

常见问题Q&A

Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10mg/ml或者70μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10μl 样品溶液和90μl Reaction Buffer以及8μl NH2-reactive Fluorescein（由步骤3所得）混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。
Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。
Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？
A:IgG的最小量为10μg。IgG的量在10μg-100μg之间时，标记比率是相同的。
Q5:标记产物能保存多久？
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。

参考文献

1) M. Hiyoshi, S. Suzu, Y. Yoshidomi, R. Hassan, H. Harada, N. Sakashita, H. Akari,   K. Motoyoshi and S. Okada, “Interaction between Hck and HIV-1 Nef Negatively Regulates Cell Surface Expression of M-CSF Receptor”, Blood, 2008, 111(1), 243.
2) W. Aung, A. Tsuji, H.   Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga,   “Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed   Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer   Model”, Molecular Imaging, 2016, 15, 1.
3) A. Shinya, K. Yamamoto, M.   Kurata, S. Abe-Suzuki, R. Horii, F. Akiyama and M. Kitagawa, “Targeting   MCM2 function as a novel strategy for the treatment of highly malignant   breast tumors”, Oncotarget., 2015, 6, (33), 34892.
4) K.M. Nishida, T.N. Okada,   T. Kawamura, T. Mituyama, Y. Kawamura, S. Inagaki, H. Huang, D. Chen, T.   Kodama, H. Siomi and M.C. Siomi, “Functional involvement of Tudor and   dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines”, EMBO J..,   2009, 28, (24), 3820.
5) P.G. Sreekumar, R. Kannan,   M. Kitamura, C. Spee, E. Barron, S.J. Ryan and D.R. Hinton, “αB   crystallin is apically secreted within exosomes by polarized human retinal   pigment epithelium and provides neuroprotection to adjacent cells”, PLoS   ONE., 2010, 5, (10), e12578.
6) R. Asano, T. Kumagai, K.   Nagai, S. Taki, I. Shimomura, K. Arai, H. Ogata, M. Okada, F. Hayasaka, H.   Sanada, T. Nakanishi, T. Karvonen, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T. Kudo,   M. Umetsu and I. Kumagai, “Domain order of a bispecific diabody dramatically   enhances its antitumor activity beyond structural format conversion: the case   of the hEx3 diabody”, Protein Eng. Des. Sel.., 2013, 26, (5), 359.
7) R. Asano, I. Shimomura, S.   Konno, A. Ito, Y. Masakari, R. Orimo, S. Taki, K. Arai, H. Ogata, M. Okada,   S. Furumoto, M. Onitsuka, T. Omasa, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T.   Kudo, M. Umetsu and I. Kumagai, “Rearranging the domain order of a diabody-based   IgG-like bispecific antibody enhances its antitumor activity and improves its   degradation resistance and pharmacokinetics”, MAbs., 2014, 6, (5), 1243.
8) R. Asano, K. Ikoma, I.   Shimomura, S. Taki, T. Nakanishi, M. Umetsu and I. Kumagai, “Cytotoxic   enhancement of a bispecific diabody by format conversion to tandem   single-chain variable fragment (taFv): the case of the hEx3 diabody”, J.   Biol. Chem.., 2011, 286, (3), 1812.
9) T. Toyotome, M. Yamaguchi,   A. Iwasaki, A. Watanabe, H. Taguchi, L. Qin, H. Watanabe and K. Kamei,   “Fetuin A, a serum component, promotes growth and biofilm formation by   Aspergillus fumigatus”, Int. J. Med. Microbiol.., 2012, 302, (2), 108.
10) W. Ma, V. Schubert, M. M.   Martis, G. Hause, Z. Liu, Y. Shen, U. Conrad, W. Shi, U. Scholz, S. Taudien,   Z. Cheng and A. Houben, “The distribution of α-kleisin during meiosis in   the holocentromeric plant Luzula elegans”, Chromosome Res.., 2016, 24,   (3), 393.
11) Y. Yokoi, K. Nakamura, T. Yoneda, M.   Kikuchi, R. Sugimoto, Y. Shimizu and T. Ayabe, “Paneth cell granule   dynamics on secretory responses to bacterial stimuli in enteroids”, Sci.   Rep.., 2019, 9, 2710.
12) Y.J. Lee, S.R. Han, N.Y.   Kim, S.H. Lee, J.S. Jeong and S.W. Lee, “An RNA aptamer that binds   carcinoembryonic antigen inhibits hepatic metastasis of colon cancer cells in   mice”, Gastroenterology., 2012, 143, (1), 155.
13) C. F.O.Hoya, K. Kushiro,   Y. Yamaoka, A. Ryo and M. Takai, ‘Rapid multiplex microfiber-based   immunoassay for anti-MERS-CoV antibody detection’, Sens Biosensing Res.,   2019,10.1016/j.sbsr.2019.100304.
14) H. Takeuchi, N Sasaki, S.   Yamaga, M. Kuboniwa, M. Matsusaki and A. Amano, “Porphyromonas   gingivalis induces penetration of lipopolysaccharide and peptidoglycan   through the gingival epithelium via degradation of junctional adhesion   molecule 1”, PLoS Pathog., 2019, 15, (11), e1008124.
15) Y. Yanase, Y. Matsuo, T.   Kawaguchi, K. Ishii, A. Tanaka , K. Iwamoto , S. Takahagi and M.Hide,   “Activation of Human Peripheral Basophils in Response to High IgE   Antibody Concentrations without Antigens”., Int J Mol Med Sci, 2019, 20,   (1), 45.
16) M. Yashiro, M. Ohya, T.   Mima, Y. Nakashima, K. Kawakami, T. Sonou, K. Tatsuta, Y. Yamano, S. Negi and   T. Shigematsu, “Excessive ADAM17 activation occurs in uremic patients   and may contribute to their immunocompromised status.”, Immun Inflamm   Dis., 2020, 10.1002/iid3.298.
17) H Fujishiro, H Yamamoto,   N Otera, N Oka, M Jinno and S. Himeno, “In vitro Evaluation of The   Effects of Cadmium on Endocytic Uptakes of Proteins into Cultured Proximal   Tubule Epithelial Cells.”, Toxics, 2020, 8,10.3390/toxics8020024
18) Y. Liu, Y. Liu, X. Zheng, L. Zhao   and X. Zhang, “Recapitulating and Deciphering Tumor Microenvironment by   Using 3D Printed Plastic Brick–Like Microfluidic Cell Patterning”, Adv   Healthc Mater, 2020, 9, (6), 1901713.

Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01 生物素标记抗体试剂

发表于由
Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂货号：BK01
生物素标记抗体试剂
Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)
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蛋白质抗体标记检测方案
试剂盒内含
产品概述
原理
操作步骤
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

1622189376355256.jpg

产品概述

水溶性活性酯型生物素化试剂：使用生物素（AC5）2Sulfo-OSu用于生物素标记蛋白质游离氨基的试剂盒。它带有用于标记的LVDS3缓冲粉，用于凝胶过滤的柱和用于柱洗脱的PBS片剂，可以纯化标记的蛋白。由于是单次注射型（10毫克x4瓶），因此可以标记4种不同类型的蛋白质。可以通过改变添加的生物素-（AC5）2 Sulfo-OSu的量来控制标记率。

*标记蛋白的量为1-5 mg。

原理

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操作步骤

使用注意事项:

1. 本试剂盒请在0-5 ℃储存。

2. Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液需要现配现用 (由于Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu易水解，尽量避免在水溶液的状态保存)。

3. 标记好的蛋白质请在0-5 ℃保存 (加入0.1%的叠氮钠等防腐剂)。

使用步骤:

1. 配制溶液

1) NaHCO3缓冲液

在含有NaHCO3粉末的容器中加入10ml超纯水溶解。

2) PBS缓冲液

在100ml容量瓶中加入1片PBS，先用少量超纯水溶解后，再用超纯水补充至100ml，制成10mmol/l的PBS缓冲液。

3) 蛋白质溶液

在样品管中精确称量1.0-5.0mg蛋白质并记录称量值后，用移液器加入500μl操作步骤1)中的NaHCO3缓冲液。盖上盖子后，用漩涡振荡器等搅拌溶解蛋白质。

4) Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液

在1支含有Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu的管子中加入适量纯水溶解。为了控制标记率，根据不同的标记对象，请参考表1调整Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液的浓度及加入量。

＊由于Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu易水解，溶解后请尽快标记。

2. 生物素标记操作方法

1) 请参考表1在配制好的蛋白质溶液中加入合适浓度和用量的Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu溶液。

2) 盖紧盖子充分混合后，在25 ℃水浴恒温摇床中培养2h。

表1 Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu标记各种蛋白质的标记率

1606900742838445.png

以上数据为本公司实际检测的结果，如实验条件变动，

结果有可能改变。标记率是根据HABA法测得。

a) 1mol蛋白质：生物素的摩尔数

b) 1mol蛋白质上所结合的生物素的摩尔数

3. 蛋白质标记后的凝胶过滤纯化

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

＊经过层析，生物素标记蛋白质的最终浓度为标记时的1/2。

按照下列公式计算生物素标记蛋白质的最终浓度：

A (mol/l) = (X/MWprotein) × (1,000/Y) × 0.5

X：蛋白质的重量

MWprotein：蛋白质的分子量

Y：溶解蛋白质的NaHCO3缓冲液体积

常见问题Q&A

Q1:如何存储标记的蛋白质？
A:将标记的蛋白质存放在冰箱中。另外，添加0.1％叠氮化钠作为防腐剂。
Q2:生物素标记试剂在水溶液中稳定吗？
A:试剂盒中使用的生物素-（AC5）2 Slufo-OSu处于水溶液中时，由于它会水解，因此无法存储在水溶液中。使用前请做好准备。另外，即使在粉末状态下，也要注意由于吸湿引起的劣化。

参考文献

1) J.   Wormmeester, F. Stiekema and C. Groot, “Immunoselective Cell Separation”, Methods Enzymol., 1990, 184, 314.
2) J. J. Leary and D. J.   Ward, “Rapid and Sensitive Colorimetric Method for Visualizing   Biotin-labeled DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Immoilized on   Nitrocelulose: Bio-blots”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 4045.
3) W. T. Lee and D. H.   Conrad, “The Murine Lymphocyte Receptor for IgE II. Characterization of   the Multvalent Nature of the B Lymphocyte Receptor for IgE”, J. Exp.   Med., 1984, 159, 1790.
4) D. R. Gretch, M. Suter and   M. F. Stinski, “The Use of Biotinylated Monoclonal Antibodies and   Streptavidin Affinity Chromatography to Isolate Herpesvirus Hydorophobic   Proteins or Glycoproteins”, Anal. Biochem., 1987, 163, 270.
5) M. Shimkus, J. Levy and T.   Herman, “A Chemically Cleavable Biotinylated Nucleotide: Usefulness in   the Recovery of Protein-DNA Complexes from Avidin Affinity Columns”,   Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2593.
6) W. J. LaRochelle and S. C.   Froehner, “Immunodhemical Detection of Proteins Biotinylated on   Nitrocellulose Replicas”, J. Immunol. Methods, 1986, 92, 65.
7) P. S. Anjaneyulu and J. V.   Staros,”Reactions of N-hydroxysulfosuccinimide Active Esters”, Int.   J. Pept. Protein Res., 1987, 30, 117.
8) H. M. Ingalls, C. M.   Goodloe-Holland and E. J. Luna,”Junctional Plasma Membrane Domains   Isolated from Aggregating Dictyostelium Discoideum Amebae”, Proc. Natl.   Acad. Sci. USA, 1986, 83, 4779.
9) J. Guesdon, T. Ternyck and   S. Avrameas,”The Use of Avidin-Biotin Interaction in Immunoenzymatic   Techniques”, J. Histochem. Cytochem., 1979, 27, 1131.

Biotin Labeling Kit – SH试剂盒货号：LK10 生物素标记试剂盒-巯基

发表于由
Biotin Labeling Kit – SH试剂盒货号：LK10
生物素标记试剂盒-巯基
Biotin Labeling Kit – SH
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温

特点：

 

● 整个标记过程仅需3个小时

● 整个标记过程在1支过滤管中进行

● 荧光标记抗体回收率高

● 适用于50-200 μg的IgG

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蛋白抗体标记检测方案
试剂盒内含
产品概述
原理
操作步骤
产品优势
常见问题Q&A
参考文献

试剂盒内含

1622187843944908.png

产品概述

生物素标记试剂盒-SH是用于在具有SH基团的蛋白质（尤其是抗体）上标记生物素的试剂盒。由于试剂盒中包含的SH反应性生物素分子中具有马来酰亚胺基团，因此仅通过与具有SH基团的分子混合即可形成稳定的共价键。如果蛋白质具有S-S键，则可以使用连接的还原剂制备游离的SH基团。（但是，由于SS键的断裂，蛋白质的活性可能会丢失。）当用生物素标记高分子量蛋白质（例如免疫球蛋白G（IgG））时，可以使用所附的过滤管轻松进行预采样。如果可以进行处理并且将铰链区中的SH基团用于标记，则可以制备生物素标记的还原IgG，而不会损害抗体活性。另外，未反应的SH-反应性生物素可以在反应后通过使用滤管的纯化操作除去。

原理

1606810815830173.png

操作步骤

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者Biotin-IgG标记物始终存在于过滤管的滤膜上。

3. 如果蛋白质溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。

4. 如果蛋白质溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 1管SH-Reactive Biotin可以标记50-200ug蛋白质。

标记IgG操作步骤

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）

（3）将150μl WS buffer加入到Reducing agent管中，并用移液器吹打使其溶解。

（4）将100μl Reducing agent溶液转移到过滤管的滤膜上，吹打使IgG在膜上溶解。

（5）37℃培养30分钟。加入100μl Reaction buffer，8,000-10,000g离心10分钟。b）

（6）将10μl DMSO加入到SH-reactive biotin中，吹打使其溶解。c）

（7）将100μl Reaction buffer与8μl SH-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）

（8）37℃培养30分钟。将100μl WS buffer加入到过滤管中8,000-10,000g离心10分钟。 b）

（9）加入200μl WS buffer，8,000-10,000g离心10分钟。b）再重复该步骤一次。

（10）加入200μl WS buffer，吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。

1622187895930177.jpg

a) 样品溶液的体积不应超过100ul。如果蛋白质浓度<0.5mg/ml，重复操作步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100ug。如果聚积过程中滤液的体积超过400 ul，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。

c) NH2-Reactive Biotin/SH-Reactive Biotin在管子的底部，向管底加入10ul DMSO，吹打数次使其溶解。

d) 如果IgG的量为200ug，在步骤4时加入所有的NH2-ReactiveBiotin溶液。

e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

产品优势

1、整个标记过程仅需3个小时

2、整个标记过程在1支过滤管中进行

3、荧光标记抗体回收率高

4、适用于50-200 μg的IgG

常见问题Q&A

Q1:样品溶液中的共存会影响反应吗？
A:它可能会受到共存类型的影响。确认溶液中包含哪种物质后，根据情况纯化用于标记的蛋白质，并将其用于标记反应。<聚合物：分子量10,000以上>它可能会影响。即使使用Filtration Tube，也无法去除具有氨基的高分子量化合物，例如BSA和明胶。因此，它被标记并充当荧光杂质。 在反应中使用之前，请执行单独的清除操作。另一方面，如果存在许多高分子杂质，即使没有氨基的化合物也可能导致过滤器堵塞。它可能会干扰标记/纯化操作。
*不仅对于生物素标记试剂盒-SH，而且对于其他标记试剂盒，都需要采取相同的预防措施。
Q2:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。

——————————————

PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33

PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33

——————————————

离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。
Q3:标记后，离心过滤管，液体仍会留在膜上怎么处理？
A:（1）目视检查隔膜时，如果液体稍微残留在隔膜杯的边缘，请继续执行下面操作。如果倾斜和旋转膜杯时液体残留在膜上或滴下，请以8,000 g离心约15至30分钟。  （2）即使在1）中的离心操作之后，如果液体仍留在膜上，请检查标记物质是否聚集。

根据抗体或蛋白质本身的特性，用小分子标记剂进行标记可能会增加抗体或蛋白质的疏水性并使其聚集。如果在标记的物质上观察到团聚，将其转移到另一个微管中一次，离心并使用上清液。 （回收的抗体/蛋白质的量将减少。）如果上述方法没有帮助，请与公司技术支持联系。

*如果您怀疑过滤器堵塞，可以通过更换新的膜过滤器来解决。

替代品：PALL Nanocep 30K（制造商代码：OD030C33）
Q4:该试剂盒可以标记什么？
A:可以标记分子量为“50,000或更高”并且具有[S-S]或[SH]的任何化合物（抗体，蛋白质等）。量为“50-200μg”。
*由于试剂盒中包含的过滤管尺寸为30K，因此无法纯化低分子量化合物。

参考文献

1) E. Terasaka, K. Yamada, P.H. Wang, K. Hosokawa, R. Yamagiwa, K. Matsumoto, S. Ishii, T. Mori, K. Yagi, H. Sawai, H. Arai, H. Sugimoto, Y. Sugita, Y. Shiro and T. Tosha, “Dynamics of nitric oxide controlled by protein complex in bacterial system”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.., 2017, 114, (37), 9888.

2) J. Hiruma, K. Harada, A. Motoyama, Y. Okubo, T. Maeda, M. Yamamoto, M. Miyai, T. Hibino and R. Tsuboi, “Key component of inflammasome, NLRC4, was identified in the lesional epidermis of psoriatic patients”, J. Dermatol.., 2018, 45, (8), 971.

3) K. Gonda, M. Watanabe, H. Tada, M. Miyashita, Y. Takahashi-Aoyama, T. Kamei, T. Ishida, S. Usami, H. Hirakawa, Y. Kakugawa, Y. Hamanaka, R. Yoshida, A. Furuta, H. Okada, H. Goda, H. Negishi, K. Takanashi, M. Takahashi, Y. Ozaki, Y. Yoshihara, Y. Nakano and N. Ohuchi, “Quantitative diagnostic imaging of cancer tissues by using phosphor-integrated dots with ultra-high brightness”, Sci. Rep.., 2017, 7, (1), 7509.

4) K. Saito, M. Sakaguchi, H. Iioka, M. Matsui, H. Nakanishi, N.H. Huh and E. Kondo, “Coxsackie and adenovirus receptor is a critical regulator for the survival and growth of oral squamous carcinoma cells”, Oncogene., 2014, 33, (10), 127401286.

5) K. Yamamoto, H. Murata, E.W. Putranto, K. Kataoka, A. Motoyama, T. Hibino, Y. Inoue, M. Sakaguchi and N.H. Huh, “DOCK7 is a critical regulator of the RAGE-Cdc42 signaling axis that induces formation of dendritic pseudopodia in human cancer cells”, Oncol. Rep.., 2013, 29, (3), 1073.

6) M. Sakaguchi, H. Murata, K. Yamamoto, T. Ono, Y. Sakaguchi, A. Motoyama, T. Hibino, K. Kataoka and N.H. Huh, “TIRAP, an Adaptor Protein for TLR2/4, Transduces a Signal from RAGE Phosphorylated upon Ligand Binding”, PLoS ONE., 2011, 6, (8), e23132.

7) M. Sakaguchi, H. Murata, Y. Aoyama, T. Hibino, E.W. Putranto, I.M. Ruma, Y. Inoue, Y. Sakaguchi, K. Yamamoto, R. Kinoshita, J. Futami, K. Kataoka, K. Iwatsuki and N.H. Huh, “DNAX-activating Protein 10 (DAP10) Membrane Adaptor Associates with Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE) and Modulates the RAGE-triggered Signaling Pathway in Human Keratinocytes”, J. Biol. Chem.., 2014, 289, (34), 23389.

8) N. Kobayashi, K. Odaka, T. Uehara, K. Imanaka-Yoshida, Y. Kato, H. Oyama, H. Tadokoro, H. Akizawa, S. Tanada, M. Hiroe, T. Fukumura, I. Komuro, Y. Arano, T. Yoshida and T. Irie, “Toward in Vivo Imaging of Heart Disease Using a Radiolabeled Single-Chain Fv Fragment Targeting Tenascin-C”, Anal. Chem.., 2011, 83, (23), 9123.

9) T. Ikeda, R. Shinohata, M. Murakami, K. Hina, S. Kamikawa, S. Hirohata, S. Kusachi, A. Tamura and S. Usui, “A rapid and precise method for measuring plasma apoE-rich HDL using polyethylene glycol and cation-exchange chromatography: a pilot study on the clinical significance of apoE-rich HDL measurements”, Clin. Chim. Acta.,2017, 465, 112.

10) T. Into, M. Inomata, M. Nakashima, K. Shibata, H. Hacker and K. Matsushita, “Regulation of MyD88-Dependent Signaling Events by S Nitrosylation Retards Toll-Like Receptor Signal Transduction and Initiation of Acute-Phase Immune Responses”, Mol. Cell. Biol.., 2008, 28, (4), 1338.

11) W. Nakai, T. Yoshida, D. Diez, Y. Miyatake, T. Nishibu, N. Imawaka, K. Naruse, Y. Sadamura and R. Hanayama, “A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles”, Sci. Rep.., 2016, 6, 33935.

12) Y. Terasaki, T. Akuta, M. Terasaki, T. Sawa, T. Mori, T. Okamoto, M. Ozaki, M. Takeya and T. Akaike, “Guanine Nitration in Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Its Implication for Carcinogenesis”, Am. J. Respir. Crit. Care Med.., 2006, 174, (6), 665.

13) I. W. Sumardika, C. Youyi, E. Kondo, Y. Inoue, I. M. W. Ruma, H. Murata, R. Kinoshita, K. Yamamoto, S. Tomida, K. Shien, H. Sato, A. Yamauchi, J. Futami, E. W. Putranto, T. Hibino, S. Toyooka , M. Nishibori and M. Sakaguchi, “β-1,3-Galactosyl-O-Glycosyl-Glycoprotein β-1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase 3 Increases MCAM Stability, Which Enhances S100A8/A9-Mediated Cancer Motility.”, Oncol. Res., 2018, 26, (3), 431.

14) J. Iwano, D. Shinmi, K. Masuda, T. Murakami and J. Enokizono, “Impact of Different Selectivity between Soluble and Membrane-bound Forms of Carcinoembryonic Antigen (CEA) on the Target-mediated Disposition of Anti-CEA Monoclonal Antibodies.”, Drug Metab. Dispos., 2019, 47, (1), 1240.

15) D. S. On, P. Chertchinnapa, Y. Shinkai, T. Kojima and H. Nakano, “Development of a dual monoclonal antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of swine influenza virus using rabbit monoclonal antibody by Ecobody technology.”, J. Biosci. Bioeng., 2020, DOI:10.1016/j.jbiosc.2020.03.003.

Biotin Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK03 生物素抗体标记试剂盒-氨基

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Biotin Labeling Kit – NH2试剂盒货号：LK03
生物素抗体标记试剂盒-氨基
Biotin Labeling Kit – NH2
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特点：

 

 

● 生物素标记的产品可以在大约2小时内制备。

● 只需将NH2反应性生物素与目标蛋白混合即可形成稳定的共价键。

● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

● 可以标记50-200μg的蛋白质。

● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

● 生物素标记的产品可以与试剂盒中包含的存储溶液一起存储。

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原理
操作步骤
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常见问题Q&A
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凑单关联产品TOP5

NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

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NO.5.    Biotin Labeling Kit – NH2 (for 1mg)    生物素标记试剂盒-氨基

 

试剂盒内含

1622187810391199.jpg

产品概述

生物素标记试剂盒-NH2是用于用生物素标记带有氨基基团的蛋白质的试剂盒，尤其是抗体，由于该试剂盒中包含的NH2-反应性生物素分子中具有活性酯基，因此仅通过与生物素混合即可形成稳定的共价键。当生物素标记在蛋白质（例如免疫球蛋白G（IgG））上时，可以使用随附的过滤管轻松去除抑制标记反应和未反应的NH2-反应性生物素的低分子量化合物（例如Tris）。因此，没有必要进行诸如透析和凝胶过滤的处理，并且可以以高回收率获得高纯度的标记化合物。

原理

1606802630883952.png

操作步骤

 

使用注意事项：

1. 用本试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者Biotin-IgG标记物始终存在于过滤管的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 1管NH2-Reactive Biotin可以标记50-200 ug蛋白质。

标记IgG操作步骤

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟。b）

（3）将10μl DMSO加入到NH2-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。c）

（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）

（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）除去滤液。

（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，b）重复该步骤一次。

（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。

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a) 样品溶液的体积不应超过100ul。如果蛋白质浓度低于0.5mg/ml，重复操作步骤1和2直至总的蛋白质聚积量达到50-200ug。如果聚积过程中滤液的体积超过400ul，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。

c) NH2-Reactive Biotin在管子的底部，向管底加入10ul DMSO，吹打数次使其溶解。

d) 如果蛋白质的量为200ug，在操作步骤4时加入所有的NH2-Reactive Biotin-DMSO溶液。

e) 并不一定要使用WS Buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

产品优势

1）生物素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）只需将NH2反应性生物素与目标蛋白混合即可形成稳定的共价键。

3）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

4）可以标记50-200μg的蛋白质。

5）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

6）生物素标记的产品可以与试剂盒中包含的存储溶液一起存储。

常见问题Q&A

Q1:这个试剂盒可以用于标记其他蛋白质吗？
A:可以。但是如果含有像血清白蛋白或者明胶的蛋白，标记反应可能会受到干扰。用这个试剂盒标记之前，有必要先纯化抗体溶液。如果您想进一步了解纯化过程可以联系我们。
Q2:我只有少量的IgG，可以标记吗？
A:在该试剂盒中，标记所需的IgG量为50至200μg。

在此范围内，性能没有太大差异。

可以用10μg IgG进行标记，但是可能会出现诸如背景升高的问题。
Q3:样品溶液中的共存会影响反应吗？
A:它可能会受到共存类型的影响。确认溶液中包含哪种物质后，根据情况纯化用于标记的蛋白质，并将其用于标记反应。

<聚合物：分子量10,000以上>它可能会影响。即使使用Filtration Tube，也无法去除具有氨基的高分子量化合物，例如BSA和明胶。因此，它被标记并充当荧光杂质。 在反应中使用之前，请执行单独的清除操作。另一方面，如果存在许多高分子杂质，即使没有氨基的化合物也可能导致过滤器堵塞。它可能会干扰标记/纯化操作。

*生物素标记试剂盒-不仅需要对NH2采取相同的预防措施，还需要对其他标记试剂盒采取相同的预防措施。
Q4:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。
A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。

当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。

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PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33

PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33

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离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。
Q5:标记后，离心过滤管，液体仍会留在膜上怎么处理？
A:（1）目视检查隔膜时，如果液体稍微残留在隔膜杯的边缘，请继续执行下面操作。如果倾斜和旋转膜杯时液体残留在膜上或滴下，请以8,000 g离心约15至30分钟。

（2）即使在1）中的离心操作之后，如果液体仍留在膜上，请检查标记物质是否聚集。根据抗体或蛋白质本身的特性，用小分子标记剂进行标记可能会增加抗体或蛋白质的疏水性并使其聚集。如果在标记的物质上观察到团聚，将其转移到另一个微管中一次，离心并使用上清液。 （回收的抗体/蛋白质的量将减少。）

*如果您怀疑过滤器堵塞，可以通过更换新的膜过滤器来解决。

替代品：PALL Nanocep 30K（制造商代码：OD030C33）
Q6:该试剂盒可以标记什么？
A:可以标记分子量为“ 50,000或更高”和反应性氨基（NH2）的化合物（抗体，蛋白质等）。标记样品量为“50-200μg”。

*当考虑标记“ mg”的量时，也可以使用“生物素化试剂盒（Sulfo-OSu）；同仁产品货号：BK01”。

*由于试剂盒附带的过滤管为30K，因此无法纯化低分子量化合物。
Q7:一个IgG分子能标记多少生物素？
A:每个IgG分子平均能标记7至10个生物素。
Q8:标记产物能保存多久？
A:在0-5℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下 (只要该蛋白可以冷冻) 存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
Q9:能不能用这个试剂盒标记寡核苷酸和寡肽？
A:不能，寡核苷酸和寡肽的分子量太小不能使其保留在过滤膜上。请参照Q4。
Q10:含有生物素标记蛋白质的活细胞怎么处理？
A:我们推荐使用PBS (含2-10% FBS) 制备细胞悬液，保持最佳细胞状态。
Q11:回收缓冲液 (WS Buffer)对活细胞有危害吗？
A:没有。WS Buffer含有表面活性剂，它的浓度控制在对细胞没有毒性的范围内。如果您担心WS Buffer中的添加剂，请您使用常用的缓冲液代替。

参考文献

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藻胆蛋白
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