脂肪酸摄取测定试剂盒——Fatty Acid Uptake Assay Kit UP07 脂肪酸摄取检测

细胞内代谢系统(糖酵解系统,TCA回路和电子转移系统)的分析对于理解细胞状态非常重要。

脂肪酸摄取测定试剂盒——Fatty Acid Uptake Assay Kit UP07 脂肪酸摄取检测
Lipi-Blue试剂 LD01 脂滴检测(蓝色)
Lipi-Green试剂 LD02 脂滴检测(绿色)
Lipi-Red试剂 LD03 脂滴检测(红色)
Lipi-Deep Red试剂 LD04 脂滴检测(深红色)
Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂 LD05 脂滴荧光检测(蓝色)
Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂 LD06 脂滴荧光检测(深红色)

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号:LD06 脂滴荧光检测(深红色)

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号:LD06
脂滴荧光检测(深红色)
Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red
商品信息
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特点:

 

● 高特异性脂滴定位

● 可流式定量检测

● 多种颜色可供选择

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概述
原理
特点
实验例
脂肪滴产品选择指南
参考文献

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凑单关联产品TOP5

NO.1.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.2.    GSSG/GSH Quantification Kit II    氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.3.    Iron Assay Kit -Colorimetric-    组织总铁含量及二价铁含量检测

NO.4.    Lipid Droplet Assay Kit-Blue    脂滴荧光检测(蓝色)

NO.5.    Mitophagy Detection Kit    线粒体自噬检测

 

试剂盒内含

1613698613829264.jpg

概述

同仁化学研究所研发的Lipid Droplet Assays Kit-Blue&Deep Red试剂盒,与油红O和尼罗红不同,只需简单操作即可选择性的检测LDs。与尼罗红相比试剂盒中的染色剂,具有更好的选择性,从而将荧光背景降低到最小值。此外,试剂盒中的Loading Buffer可维持检测过程中细胞的状态完好。本试剂盒可使用流式细胞仪检测活细胞或固定细胞,也可用于荧光酶标仪进行高通量检测。

原理

脂滴(脂肪滴,Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成,主要包括甘油三酯和胆固醇酯,其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在,在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明,以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器,但最近的研究表明其在调节脂质代谢1),自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用,因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针,可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后,无须洗涤即可观察到脂滴。

1606799822754601.png

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

特点

特点1:定量专用试剂盒

试剂盒包含所需的工作液和缓冲液、可以简便实现定量脂滴。

1609297340714105.png

特点2:大幅度缩短操作,活细胞也可以使用

Lipid Droplet Assay Kit中使用的荧光染料可用于活细胞和固定细胞。因此,与使用比色法试剂相比可以大大缩短检测所需的时间。此外,由于染料不会沉积在孔板上,所以可以提高实验的重现性。

1609297357289693.png

实验例

实验例1:孔板检测实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂)分别加入到A549细胞中,并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明,与对照和加入Triacsin C的细胞相比,加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

1609297394927428.png

<检测条件>

Blue:Ex: 376 – 386 nm、 Em: 435 – 455 nm

Deep Red :Ex: 623 – 633 nm、 Em: 649 – 669 nm

实验例2:流式细胞术的实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂)分别加入到HeLa细胞中,并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明,与对照和加入Triacsin C的细胞相比,加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

1609297411162424.png

< 检测条件>

Blue:Ex: 405 nm、 Em: 425 – 475 nm

Deep Red :Ex: 640 nm、 Em: 650 – 670 nm

脂肪滴产品选择指南

产品名称 规格 货号
成像(成像)

脂滴荧光探针

Lipi-Blue 10 nmol LD01
Lipi-Green 10 nmol LD02
Lipi-Red 100 nmol LD03
Lipi-Deep Red 10 nmol LD04
定量(荧光酶标仪,FCM)
脂滴荧光检测试剂盒
Lipid Droplet Assay Kit – Blue 1 set LD05
Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red 1 set LD06

参考文献

1. Fujimoto,T.et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits”Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2. Singh,R.et al., “Autophagy regulates lipid metabolism”Nature2009, 458(7242), 1131.

3. Yokoyama, M.et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity”Cell Reports2014, 7(5), 1691.

4. Oka, M.et al.,  “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373.

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氧消耗量检测试剂盒
Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒-Green
葡萄糖摄取检测试剂盒
ADP/ATP比率检测试剂盒—ADP/ATP Ratio Assay Kit-Luminescence
ADP/ATP比率检测试剂盒

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号:LD05 脂滴荧光检测(蓝色)

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号:LD05
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Lipid Droplet Assay Kit-Blue
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特点:

 

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概述
原理
特点
实验例
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NO.1.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.2.    Lipid Droplet Assay Kit-Blue    脂滴荧光检测(蓝色

NO.3.    Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red    脂滴荧光检测(深红色)

NO.4.    Glucose    葡萄糖摄取检测

NO.5.    Lactate Assay Kit-WST    乳酸检测

 

试剂盒内含

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概述

同仁化学研究所研发的Lipid Droplet Assays Kit-Blue&Deep Red试剂盒,与油红O和尼罗红不同,只需简单操作即可选择性的检测LDs。与尼罗红相比试剂盒中的染色剂,具有更好的选择性,从而将荧光背景降低到最小值。此外,试剂盒中的Loading Buffer可维持检测过程中细胞的状态完好。本试剂盒可使用流式细胞仪检测活细胞或固定细胞,也可用于荧光酶标仪进行高通量检测。

原理

脂滴(脂肪滴,Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成,主要包括甘油三酯和胆固醇酯,其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在,在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明,以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器,但最近的研究表明其在调节脂质代谢1),自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用,因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针,可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后,无须洗涤即可观察到脂滴。

1606799822754601.png

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

特点

特点1:定量专用试剂盒

试剂盒包含所需的工作液和缓冲液、可以简便实现定量脂滴。

1609297340714105.png

特点2:大幅度缩短操作,活细胞也可以使用

Lipid Droplet Assay Kit中使用的荧光染料可用于活细胞和固定细胞。因此,与使用比色法试剂相比可以大大缩短检测所需的时间。此外,由于染料不会沉积在孔板上,所以可以提高实验的重现性。

1609297357289693.png

实验例

实验例1:孔板检测实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂)分别加入到A549细胞中,并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明,与对照和加入Triacsin C的细胞相比,加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

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<检测条件>

Blue:Ex: 376 – 386 nm、 Em: 435 – 455 nm

Deep Red :Ex: 623 – 633 nm、 Em: 649 – 669 nm

实验例2:流式细胞术的实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂)分别加入到HeLa细胞中,并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明,与对照和加入Triacsin C的细胞相比,加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

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< 检测条件>

Blue:Ex: 405 nm、 Em: 425 – 475 nm

Deep Red :Ex: 640 nm、 Em: 650 – 670 nm

脂肪滴产品选择指南

产品名称 规格 货号
成像(成像)

脂滴荧光探针

Lipi-Blue 10 nmol LD01
Lipi-Green 10 nmol LD02
Lipi-Red 100 nmol LD03
Lipi-Deep Red 10 nmol LD04
定量(荧光酶标仪,FCM)
脂滴荧光检测试剂盒
Lipid Droplet Assay Kit – Blue 1 set LD05
Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red 1 set LD06

参考文献

1. Fujimoto,T.et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits”Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2. Singh,R.et al., “Autophagy regulates lipid metabolism”Nature2009, 458(7242), 1131.

3. Yokoyama, M.et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity”Cell Reports2014, 7(5), 1691.

4. Oka, M.et al.,  “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373.

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氧消耗量检测试剂盒
Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒-Green
葡萄糖摄取检测试剂盒
ADP/ATP比率检测试剂盒—ADP/ATP Ratio Assay Kit-Luminescence
ADP/ATP比率检测试剂盒

Lipi-Deep Red试剂货号:LD04 脂滴检测(深红色)

Lipi-Deep Red试剂货号:LD04
脂滴检测(深红色)
Lipi-Deep Red
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● 高特异性脂滴定位

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产品解说
概述
原理
脂滴的染色例
与竞争品比较
产品特点
实验例
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
常见问题Q&A

产品解说

 

概述

 Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针,其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。

原理

脂滴(脂肪滴,Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成,主要包括甘油三酯和胆固醇酯,其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在,在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明,以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器,但最近的研究表明其在调节脂质代谢1),自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用,因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针,可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后,无须洗涤即可观察到脂滴。

1606799822754601.png

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

脂滴的染色例

在活细胞状态下,用油酸诱导HeLa细胞后,用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测

1608085752373328.png

检测条件:

* Lipi-Blue : Ex: 405 nm, Em: 450–500 nm

* Lipi-Green: Ex: 488 nm, Em:500–550 nm

* Lipi-Red: Ex: 561 nm, Em: 565–650 nm

* Lipi-Deep Red: Ex: 640 nm, Em: 650–700 nm

染色条件:

 

在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸,过夜培养后,用PBS清洗细胞,并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red:0.1 μmol/l、Lipi-Red:1 μmol/l) 染色15 min后观察。

如何制备油酸溶液

请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。

与竞争品比较

Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性,滤波器的适应性,荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验,可选颜色更多。

 

同仁化学试剂 其他品牌(T公司)
Lipi-Blue Lipi-Green Lipi-Red Lipi-Deep Red Oil Red O

(比色)

Nile Red 试剂B
活细胞染色 ×
固定细胞染色
对脂肪滴的选择性
(低背景)
× ×
与其他试剂的共染色*1 *2 n.d. ×*3
活细胞内的滞留性(24h) × × n.d. × ×

*1. 与绿色荧光共染时,推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。

*2. 关于共染时推荐的荧光滤光片,您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。

*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。

产品特点

特点1:高特异性定位脂滴

在HeLa活细胞中加入油酸,并用100 nmol/l Lipi-Deep Red 和100 nmol/l Nile Red(T公司)染色。结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。

1609305949175013.png

 

<检测条件>

Lipi-Deep Red: Ex: 640 nm / Em: 650 – 700 nm

Nile Red: Ex: 561 nm / Em: 565 – 650 nm

特点2:荧光在细胞中的滞留时间长

 

分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞,观察在培养30 min和24 h时的荧光图像。

1608085555762666.png

实验证实Lipi-Blue和Lipi-Green在培养24 h后虽然荧光强度有所降低,但仍有荧光。 而Lipi-Red,Lipi-Deep Red,Nile Red和市售试剂B在 培养24 h后几乎无荧光,不适合长时间的实时成像观察。

实验例

实验例1:脂肪细胞的脂滴成像

用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞,可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。

染色例_3.png

<脂肪细胞染色实验例>

(1)将3T3-L1细胞(1.5×104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板(ibidi)的各孔中,并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。

(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。

(3) 去除上清液,用DMEM(25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红)洗涤两次。

(4)加入用DMEM(25 mmol/l葡萄糖,10%FBS,无酚红)制备的每种染料的工作溶液,并在37℃下培养24 h。

(5)用荧光显微镜观察。

※试剂浓度:各2.5 µmol/l

实验例2:脂肪组织的脂滴成像

用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色,比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像,发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。1622182689922281.png

<组织样品的染色实验例>

(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS),在室温下静置5 min。

(2)用PBS清洗后,加入各浓度的Lipi系列working solution(PBS),在4℃下静置24 h。

(3)用PBS清洗后,用落射型荧光显微镜进行荧光观察。

※工作液浓度:2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)

Lipi系列荧光图谱

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脂肪滴产品种类的检测方法

产品名称 规格 货号
成像(成像)

脂滴荧光探针

Lipi-Blue 10 nmol LD01
Lipi-Green 10 nmol LD02
Lipi-Red 100 nmol LD03
Lipi-Deep Red 10 nmol LD04
定量(荧光酶标仪,FCM)
脂滴荧光检测试剂盒
Lipid Droplet Assay Kit – Blue 1 set LD05
Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red 1 set LD06

常见问题Q&A

Q1:油酸溶液的制备和加入细胞的方法
A1:我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。
<油酸储存溶液>
必要的试剂
·BSA(牛血清白蛋白)
·油酸
·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)
制备步骤
1)在0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)中加入BSA并溶解(BSA:浓度0.14 g/ml)。
2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后,加入步骤1)得到的BSA溶液,使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度:4 mmol/l)。*1
3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。
4)每次使用后冷藏保存。*2
* 1   油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊,继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。
* 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中,用于将油酸加入到细胞中。
<加入细胞的方法>
1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。
2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换,再培养24 h。
3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。
Q2:共染时推荐的荧光滤光片。
1622182766133966.png

 

 

Q3:检测不到荧光信号的应对方法是什么?
  Q4如果没有检测到荧光信号,可能会有几个因素。
请确认以下内容,并根据情况考虑优化条件。
1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。
确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。
2.染色条件不是最合适的。
[试剂浓度]
确认工作液的浓度是否在以下范围内。
Lipi-Blue,Lipi-Green:0.1-0.5μmol/l
Lipi-Red:1-5μmol/l
*如果在上述条件下仍未检测到荧光信号,请提高染色浓度。
Lipi-Blue,Lipi-Green:1-2μmol/l
Lipi-Red:10-20μmol/l
[染色时间]
-一般是30min,如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。
3.固定条件不适合。
根据细胞种类不同,染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。
在这种情况下,“请参考Q&A:是否可以对固定细胞进行染色?。
4.脂滴小,难以确认。
根据细胞的不同,可能会有脂滴很小难以确认的情况。
这种情况下,我们建议在高倍率的显微镜下确认,或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。
Q4:是否可以对固定细胞进行染色?
A4:可以染色,固定细胞的染色步骤有以下注意事项:
※请用多聚甲醛 (PFA) 固定细胞,不建议用甲醇等醇类固定细胞,因为可能会影响脂滴的结构。
※部分细胞种类染色后,如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况,需要摸索最佳固定条件。
○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例)
1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上,并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基,用PBS清洗2次。
3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液,在37℃培养箱中培养15 min。
4. 去除上清液,用PBS清洗2次。
5. 加入4% PFA (在PBS中),在室温固定5 min。
6. 去除上清液,用PBS清洗后,在荧光显微镜下观察。
○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例)
1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上,并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基,用PBS清洗2次。
3. 加入4% PFA (在PBS中),在室温固定5 min。
4. 去除上清液,用PBS清洗2次。
5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液,在37℃培养箱中培养30 min。
6. 去除上清液,用PBS清洗后,在荧光显微镜下观察。

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Lipi-Red试剂货号:LD03 脂滴检测(红色)

Lipi-Red试剂货号:LD03
脂滴检测(红色)
Lipi-Red
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特点:

 

● 高特异性脂滴定位

● 可进行组织脂滴成像

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概述
原理
脂滴的染色例
与竞争品比较
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NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

NO.2.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.3.    Glucose Assay Kit-WST    葡萄糖检测

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    MitoPeDPP    线粒体内脂质过氧化物检测

 

概述

 Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针,其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。

原理

脂滴(脂肪滴,Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成,主要包括甘油三酯和胆固醇酯,其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在,在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明,以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器,但最近的研究表明其在调节脂质代谢1),自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用,因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针,可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后,无须洗涤即可观察到脂滴。

1606957135711969.png

 

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

脂滴的染色例

在活细胞状态下,用油酸诱导HeLa细胞后,用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测

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检测条件:

* Lipi-Blue :Ex:405 nm, Em:450–500 nm

* Lipi-Green:Ex:488 nm, Em:500–550 nm

* Lipi-Red:Ex:561 nm, Em:565–650 nm

* Lipi-Deep Red:Ex:640 nm, Em:650–700 nm

染色条件:

在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸,过夜培养后,用PBS清洗细胞,并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red:0.1 μmol/l、Lipi-Red: 1 μmol/l) 染色15 min后观察。

如何制备油酸溶液

请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。

与竞争品比较

Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性,滤波器的适应性,荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验,可选颜色更多。

同仁化学试剂 其他品牌(T公司)
Lipi-Blue Lipi-Green Lipi-Red Lipi-Deep Red Oil Red O

(比色)

Nile Red 试剂B
活细胞染色 ×
固定细胞染色
对脂肪滴的选择性
(低背景)
× ×
与其他试剂的共染色*1 *2 n.d. ×*3
活细胞内的滞留性(24h) × × n.d. × ×

*1. 关于共染色时推荐的荧光滤光片,您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。

*2. 与绿色荧光共染色时,推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。

*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。

产品特点

特点1:与抗体检测方法高度相关

用4%PFA固定HepG2细胞后,用1 μmol/l Lipi-Red 染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记,免疫染色,该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。实验证明Lipi-Red 与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。

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<检测条件> 

Lipi-Red:Ex: 405 nm / Em: 450-500 nm,

抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647):Ex: 640 nm / Em: 650-700 nm

特点2:高特异性定位脂滴

在HeLa活细胞中加入油酸,并用1μmol/L Lipi-Red和100 nmol/l Nile Red(T公司)染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。

1608089533370988.png

<检测条件> 

Lipi-Red: Ex: 561 nm / Em: 565 – 650 nm

Nile Red:Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

特点3:光谱范围更窄,不易串色(Lipi-Red vs Nile Red)

在单通道情况下,Lipi Red和Nile Red(T公司)染色HepG2会用G激发观察红色荧光。而在多重染色情况下,可能会用B激发观察绿色荧光,此时Nile Red会出现串色现象。

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在用Lipi-Red染色的细胞中,确认了由于G激发引起的红色荧光,并且没有确认由于B激发引起的绿色荧光泄漏。 另一方面,在用尼罗红染色的细胞中,观察到由于G激发引起的红色荧光,但是由于B激发而观察到绿色荧光的泄漏。

特点4:荧光在细胞中的滞留时间长

分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞,观察在培养30 min和24 h的荧光图像。

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实验例

用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞,可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。

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<脂肪细胞染色实验例>

(1)将3T3-L1细胞(1.5×104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板(ibidi)的各孔中,并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。

(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。

(3) 去除上清液,用DMEM(25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红)洗涤两次。

(4)加入用DMEM(25 mmol/l葡萄糖,10%FBS,无酚红)制备的每种染料的工作溶液,并在37℃下培养24 h。

(5)用荧光显微镜观察。

※试剂浓度:各2.5 µmol/l

实验例2:脂肪组织的脂滴成像

用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色,比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像,发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。

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<组织样品的染色实验例>

(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS),在室温下静置5 min。

(2)用PBS清洗后,加入各浓度的Lipi系列working solution(PBS),在4℃下静置24 h。

(3)用PBS清洗后,用落射型荧光显微镜进行荧光观察。

※工作液浓度:2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)

实验例3:使用细胞成像仪进行定量分析

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂)分别加入到HepG2细胞中,并比较脂滴的变化。在分析中,我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。

脂肪滴和细胞核的成像

使用共聚焦定量细胞成像仪在617/73 nm处拍摄脂滴图像,在447/60 nm处拍摄细胞核图像,在分析软体CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核,并计算其数量和面积。

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横河电机CQ1拍摄条件

使用板:96 well plate,物镜:20倍

激发波长 :405 nm (DAPI):):蓝色、561 nm (Lipi-Red): 红色

紫框线:细胞核、黄框线:脂滴

脂滴数量及面积的分析

根据细胞核和脂滴的检测数据,每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果,加入油酸的脂滴增加了7-13倍,而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成,脂滴数量减少到Control组的60%。

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细胞处理及脂滴染色条件

将HepG2细胞(1×103cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后,加入未处理(仅含FBS的DMEM培养基)、油酸(含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基)或Triacsin C(含5 μmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基)过夜培养。之后用PBS 清洗2次,用4%的PFA在室温下固定5 min后,用PBS 清洗2次。最后,加入1 μmol/l Lipi-Red working solution 在室温、避光下染色2 h后,用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。

Lipi系列荧光图谱

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脂肪滴产品种类的检测方法

产品名称 规格 货号
成像(成像)

脂滴荧光探针

Lipi-Blue 10 nmol LD01
Lipi-Green 10 nmol LD02
Lipi-Red 100 nmol LD03
Lipi-Deep Red 10 nmol LD04
定量(荧光酶标仪,FCM)
脂滴荧光检测试剂盒
Lipid Droplet Assay Kit – Blue 1 set LD05
Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red 1 set LD06

常见问题Q&A

Q1:油酸溶液的制备和加入细胞的方法
A1:我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。
<油酸储存溶液>
必要的试剂
·BSA(牛血清白蛋白)
·油酸
·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)
制备步骤
1)在0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)中加入BSA并溶解(BSA:浓度0.14 g/ml)。
2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后,加入步骤1)得到的BSA溶液,使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度:4 mmol/l)。*1
3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。
4)每次使用后冷藏保存。*2
* 1   油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊,继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。
* 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中,用于将油酸加入到细胞中。
<加入细胞的方法>
1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。
2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换,再培养24 h。
3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。
Q2:共染时推荐的荧光滤光片。
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Q3:检测不到荧光信号的应对方法是什么?
  Q4如果没有检测到荧光信号,可能会有几个因素。
请确认以下内容,并根据情况考虑优化条件。
1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。
确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。
2.染色条件不是最合适的。
[试剂浓度]
确认工作液的浓度是否在以下范围内。
Lipi-Blue,Lipi-Green:0.1-0.5μmol/l
Lipi-Red:1-5μmol/l
*如果在上述条件下仍未检测到荧光信号,请提高染色浓度。
Lipi-Blue,Lipi-Green:1-2μmol/l
Lipi-Red:10-20μmol/l
[染色时间]
-一般是30min,如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。
3.固定条件不适合。
根据细胞种类不同,染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。
在这种情况下,“请参考Q&A:是否可以对固定细胞进行染色?。
4.脂滴小,难以确认。
根据细胞的不同,可能会有脂滴很小难以确认的情况。
这种情况下,我们建议在高倍率的显微镜下确认,或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。
Q4:是否可以对固定细胞进行染色?
A4:可以染色,固定细胞的染色步骤有以下注意事项:
※请用多聚甲醛 (PFA) 固定细胞,不建议用甲醇等醇类固定细胞,因为可能会影响脂滴的结构。
※部分细胞种类染色后,如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况,需要摸索最佳固定条件。
○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例)
1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上,并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基,用PBS清洗2次。
3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液,在37℃培养箱中培养15 min。
4. 去除上清液,用PBS清洗2次。
5. 加入4% PFA (在PBS中),在室温固定5 min。
6. 去除上清液,用PBS清洗后,在荧光显微镜下观察。
○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例)
1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上,并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基,用PBS清洗2次。
3. 加入4% PFA (在PBS中),在室温固定5 min。
4. 去除上清液,用PBS清洗2次。
5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液,在37℃培养箱中培养30 min。
6. 去除上清液,用PBS清洗后,在荧光显微镜下观察。
Q5:绿色滤光片会有荧光泄露吗。
A5:与市场上的Nile   Red相比,Lipi-Red的泄漏较少,但根据滤光片的种类和激发光的强度,荧光又可能会泄漏到绿色滤光片中。在观察带有不同染料的绿色滤光片时,请注意以下几点。

·选择550 nm以下绿色荧光滤光片。

·一边调整激发光的强度,一边检测荧光。

参考文献

1) Y. Tatenaka, H. Kato, M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, H. Nishitoh and Y. Ueno, “Monitoring Lipid Droplet Dynamics in Living Cells by Using Fluorescent Probes”, Biochemistry., 2019, DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01071 .

2) M. Oka, N. Kobayashi, K. Matsumura, M. Nishio and K. Saeki, “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373.

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Fatty Acid Uptake Assay Kit
商品信息
储存条件:0-5度保存
运输条件:常温

特点:

 

● 灵敏度高,操作简便

● 操作简单三步即可完成实验

● 无需清洗细胞

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宣传资料
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100tests
期货
产品解说
试剂盒内含
产品概述
检测产品优势
选择指南
产品Q&A

产品解说

 

试剂盒内含

image.png

产品概述

该试剂盒使用Fatty Acid Uptake Probe作为脂肪酸类似物,通过位于细胞膜表面的脂肪酸转运蛋白进入细胞,可以通过荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪等荧光测量方法检测细胞的摄取能力。此外,该试剂盒配备了Quenching Buffer,可消除未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe的荧光,因此无需清洗细胞也可以检测。

检测产品优势

 

为什么脂肪酸摄取能力越来越受到关注?

脂肪酸是为生物体供应能量的重要物质。脂肪酸摄取能力不仅与肥胖和糖尿病等疾病有关,也是癌细胞的代谢指标之一(左下图)。细胞增殖活跃的癌细胞往往需要很多脂质,所以细胞内的脂肪酸合成和细胞外的脂肪酸摄取很活跃(右下图)。因此,以癌细胞的脂肪酸代谢途径为目标,开发了很多药物。

1665475248585592.png1665475280244946.png

用单个试剂盒即可解决整个脂肪酸摄取实验!

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本试剂盒所内含的脂肪酸类似物通过脂肪酸转运体被转运至细胞内,再通过荧光探针(荧光法)检测该类似物的摄入量【检测原理】。Quenching buffer可以省去清洗操作的麻烦和时间成本,进行检测【操作步骤】。

检测原理

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操作步骤

1665475458696616.png

检测仪器

HepG2细胞通过添加脂肪酸转运蛋白抑制剂CB-2,在不同仪器中检测其脂肪酸摄取能力的变化。

1665475487584787.png

选择指南

Washing Buffer或Quenching Buffer的选择指南

请参考下表,根据细胞种类和实验系统(操作和测量装置)选择Washing Buffer或Quenching Buffer。

〇:可测量、×:不可测量、△:参考注释

Washing Buffer (10×) Quenching Buffer
贴壁细胞 悬浮细胞 贴壁细胞 悬浮细胞
清洗操作 必要 不需要
荧光酶标仪 底部读数(透明底) △※1
顶部读数 ×
荧光显微镜
激光共聚焦显微镜 △※2
流式细胞仪 ×

※1接种的细胞需要覆盖板底(大约:3x105cells/well),使之静置一段时间,从而可检测在板底的贴壁细胞。

※2使用激光共聚焦显微镜时,请将Quenching Buffer用Washing Buffer稀释10倍后使用,如果不能使用ex:488nm,请使用ex:640nm进行检测。

实验例

确认细胞中脂肪酸代谢状态

在A549细胞中添加不含葡萄糖或含有25mmol/l葡萄糖的DMEM培养基,制备了正常状态(control)和饥饿状态(Starved)的两组细胞。使用本试剂盒对两组细胞进行染色,并使用荧光显微镜观察。

结果显示,在对照组细胞中,荧光素大多聚集在脂肪滴中,而在饥饿状态的细胞中荧光素主要集中在线粒体和内质网上。由此可看出在饥饿状态下的细胞脂肪酸代谢的变化。

1665476343582003.png

对照组细胞和饥饿组细胞的荧光图

1665476375765131.png

*供参考的可检测数:35 mm dish 10块、 96孔板 1 块

产品Q&A

Q: 可用于哪些种类的细胞
A:在下述细胞中有使用实例。

 

细胞 由来
A549 人肺泡基底上皮腺癌细胞
HepG2 人肝癌细胞
HeLa 人宫颈癌细胞
Jurkat 人白血病T细胞
MOLT-4 人急性淋巴白血病细胞
3T3-L1 (preadipocyte) 前脂肪細胞
3T3-L1 (adipocyte) 脂肪細胞

 

Q: 将Fatty Acid Uptake Probe孵育进活细胞后,可以固定细胞吗?
A:<实验例>使用4%PFA固定染色后的细胞实验案例

Protocol:贴壁细胞

1.     将制备好的细胞接种在培养皿或96孔板上;

2.     用无血清培养基洗涤两次;

3.     加入无血清培养基,在培养箱(37℃,5%CO2存在下)中静置孵育15 min;

4.     去除上清液,添加Fatty Acid Uptake Probe working solution,在培养箱(37℃、5%CO2存在下)中静置15 min;

5.     去除上清液,用Washing Buffer solution清洗1次;

6.     向细胞中加入4%PFA/PBS并在室温下孵育5 min;

7.     用PBS洗涤细胞3次,用荧光显微镜检测,荧光酶标仪检测。

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8fdfa63cc177ba94974f267f0abff7b.png

※固定会降低荧光强度

悬浮细胞

1.      取细胞样品至微管中;

2.      300×g离心5min,去除上清液;

3.      加入无血清培养基,300×g离心5min,去除上清液,重复两次;

4.      加入无血清培养基,混匀细胞,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min;

5.      300×g离心5 min,去除上清液;

6.      加入Fatty Acid Uptake Probe working solution,混匀细胞,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min ;

7.      300×g离心5min,去除上清液;

8.      用Washing Buffer solution清洗一次;

9.      加入4%PFA/PBS,混匀细胞,在室温下孵育5 min;

10.    300×g离心5 min,去除上清液;

11.    加入PBS,混匀细胞,300×g离心5 min,去除上清液;重复两次。

12.    用荧光显微镜或流式细胞仪检测。

1665476467676262.png

Q: 用荧光酶标仪检测时,应该用哪种板子?
A: 检测荧光,请使用细胞培养用的黑色孔板。

〇:可使用、×:不可使用、△:参考注释

 

贴壁细胞 悬浮细胞
不透明底 透明底 不透明底 透明底
Washing Buffer (10×) Top Reading
Bottom Reading × ×
Quenching Buffer Top Reading × ×
Bottom Reading × × △※

※接种的细胞需要覆盖板底,使之静置一段时间,从而可检测在板底的贴壁细胞。

〈使用Quenching Buffer时,悬浮细胞的数据〉

1665477515110488.png

实验案例使用孔板:

 

厂家 产品名 Cat No.
ibidi µPlate 96 well   ibiTreat black S 15 ib89626
Thermo   Fisher 96 Well Black/Clear   Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10 165305

 

Q: Fatty Acid Uptake Probe working solution可以保存吗?
A:无法保存。
Q:背景较高怎么办?
A:样品中可能存在未进入细胞的Fatty Acid Uptake Probe。可重复使用Washing Buffer solution清洗,或者考虑使用Quenching Buffer。
Q:试剂盒可检测的样品数量是多少?
A:请参照下表。

 

贴壁细胞 悬浮细胞
培养皿

(添加量)

6   well

(1.5   ml/well)

24-well

(0.3   ml/well)

 

96-well

(0.1   ml/well)

 

35-mm   dish

(1.5   ml/well)

 

1.5-ml   microtube

(0.5   ml/tube)

 

样本数 7   sample 34   sample 100   sample 7   sample 20   sample

 

Q:使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测,应该怎么做?
A:使用Quenching Buffer用激光共焦显微镜进行检测时,请将Quenching Buffer用Washing Buffer solution稀释10倍后使用,或者使用640nm激发光检测。

<用用激光共焦显微镜进行透射光观察时所看到的现象>

1665478016663968.png

Q:可以进行脂肪酸定量吗?
A:不能使用本产品定量脂肪酸。
Q:可以量化细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe吗?
A:无法定量细胞内摄取的Fatty Acid Uptake Probe。该试剂是为了确认脂肪酸摄取能力的增减的配合用试剂。
Q:可以和其他荧光染料共染吗?
A:Fatty Acid Uptake Probe是使用红色荧光观察。因此,请使用绿色或者红色荧光检测以外的试剂进行共染色。

与本公司线粒体染色试剂MitoBright LT Deep Red(MT12)共染色的实绩。

〈进入红色荧光〉

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〈与MitoBright LT Deep Red共染色〉

1. 制备细胞样品接种到培养皿或者孔板中;

2.去除培养基,用无血清培养基洗涤两次;

3.加入无血清培养基,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min;

4.去除上清液后,添加Fatty Acid Uptake Probe working solution,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置15 min;

5. 去除上清液后,添加0.1µmol/l MitoBright LT working solution,在培养箱(37℃,5%CO2)中静置30 min;

6. 去除上清液后,用HBSS洗涤两次;

7.加入HBSS并用荧光显微镜观察。

1665478420992147.png

Q: 荧光显微镜观察时有什么注意事项吗?
A:荧光显微镜观察时,如果持续照射激发光,Fatty Acid Uptake Probe的荧光可能会淬灭。请控制连续的激发光的照射次数。

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α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号:K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号:K261
α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)
α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric
商品信息
储存条件:0-5度保存
运输条件:常温

特点:

 

● 检测结果的重现性好

● 可作为线粒体活性的指标

● 多角度了解细胞代谢变化

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选择规格:
100tests
现货
产品解说
规格性状
产品概述
检测原理
检测操作
标准曲线的作成例
实验例
常见问题Q&A

产品解说

 

规格性状

100 tests     ・Fluorescent Dye
・α-KG   Standard
・Enzyme Mix
・Coenzyme
・Assay Buffer
・lysis Solution
・Control Buffer
・ALT   Solution
・Reaction Buffer
×1
300 μl×1
×1
×1
6.5 ml×1
2 ml×1
25 ml×1
35 μl×1
5 ml×1

产品概述

α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中重要的中间体。它被作为进入TCA循环的葡萄糖代谢物增加的指标以及谷氨酰胺代谢(Glutaminolysis,一种谷氨酰胺底物与α-KG反应的通路)增加的指标。α-KG在神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的产生中起着重要作用,不仅如此它还担负着一定的清除细胞内的活性氧的功能,是非常重要的细胞代谢指标之一。

检测原理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric可以定量检测α-酮戊二酸(α-KG)。通过检测反应生成的试卤灵(Resorufin)的荧光(Ex:530 – 560 nm、Em:580 – 600 nm)对细胞内的α-KG进行定量。另外,本试剂盒还可以通过使用96孔板进行多样品检测。

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检测操作

整个操作过程,从细胞的前处理到荧光酶标仪检测,只需要按照操作说明书的步骤添加试剂即可检测细胞内α-酮戊二酸(α-KG)的浓度。而且,本试剂盒专门针对同类型检测方法中普遍存在的结果重现性差的问题进行了优化,即使是第一次做α-KG检测实验的科研人员也可以放心使用。

► 结果重现性高的两个秘诀

1) 样品的前处理

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同类型的检测试剂盒在样品前处理时需要微量的pH调节、过滤膜过滤等操作,这是导致结果重现性差的原因之一。而同仁化学研究所的α-KG检测试剂盒,只需要按照说明书添加试剂,可以大幅减少前处理过程中产生的操作误差。

2) α-Ketoglutarate的检测

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其他检测试剂盒使用与上图相同的原理,但是由于①和②的两步反应同时在96孔板里进行,这是造成误差的另一个重要原因。而同仁化学研究所的试剂盒将这两步反应分开进行,进一步降低了误差。

标准曲线的作成例

本试剂盒附带α-KG的标准品,可以通过制作标准曲线来定量的检测样品中的α-KG浓度。如果样品中的α-KG浓度高于20 μmol/l,请预先稀释样品再检测。

图片5.jpg

实验例

Doxorubicin(DOX)刺激引起的细胞内代谢变化

阿霉素(Doxorubicin, DOX)可以作用于 细胞周期的G2/M期,停止细胞的增殖并且细胞衰老,利用DOX作用于A549细胞,会导致胞内α-KG浓度增加。另外通过SG 03 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal检测细胞衰老、C548 Cell Cycle Assay Solution Deep Red / C549 Cell Cycle Assay Solution Blue检测细胞周期、MT09 JC-1 MitoMP Detection Kit检测线粒体膜电位的结果如下:

image.png

图片8.png

 

1648718544826538.png1648718550521530.png

Sulfasalazine(SSZ)引起的细胞内代谢变化

Sulfasalazine(SSZ)可以抑制细胞的胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)。用SSZ刺激A549细胞后,细胞内的α-KG、ATP、GSH、细胞放出的谷氨酸等变化用下列方法进行了检测。结果发现,SSZ刺激后细胞内的ATP、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸的放出量均减少,而细胞内的α-KG和ROS水平增加。1648718906334129.jpg

<使用产品>

・细胞内ATP:CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・细胞内GSH:G263 GSSG/GSH Quantification Kit II

・细胞内ROS:R252 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-

・胞外谷氨酸:G269 Glutamate Assay Kit-WST

 

 

<实验条件>

细胞:A549细胞(1 x 106 cells) 暴露时间: 48 h

 

图片5.png

参考文献) Shogo Okazaki et al., “Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”. Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

NASH诱导小鼠的肝脏组织的代谢变化

NASH(非酒精性脂肪肝)的病变组织中有ATP、α-KG、NAD的量减少的特点。使用4周龄的高脂肪食物投喂(引发NASH)的1型糖尿病模型小鼠(STAM模型)的肝脏组织,检测其中的ATP、α-KG、NAD水平的变化。结果显示,NASH诱导后10周龄的小鼠组中ATP、α-KG、NAD的浓度降低。

1648776699547364.png

※详细的实验步骤请参考FAQ“是否有检测组织的实验例

 

<使用产品>

 

・组织内ATP:CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・组织内NAD:N509 NAD/NADH Assay Kit-WST

 

<实验参考文献>

 

ATP Francesco   Bellanti, et al., “Synergistic   interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and   limits liver adaptation during nafld   progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96.
α-KG Jianjian   Zhao, et al., “The   mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic   stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3).
Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine   L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty   Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44.
NAD Jinhan   He, et al., “Activation   of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic   Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase   Sirt3”, Mol.   and Cell. Biol., 2013, 33, (10),   2047-55.

 

 

常见问题Q&A

Q1:每个试剂盒可以检测所少个样品?
A1:如果标准曲线和样品都采用3个复孔来计算,可以检测12个样品。具体的96孔板的样品孔排列实例请见说明书。

 

Q2:是否可以用黑色孔板以外的孔板(透明板或白色板)?
A2:用透明板或白色板无法准确的绘制标准曲线,请使用黑色96孔板进行实验

 

Q3:检测时样品没有显色,可能的原因有哪些?
A3:本试剂盒对α-KG的检测范围是0.2 μmol/l以上,样品中的α-KG浓度如果低于0.2 μmol/l无法检测出来。可以尝试降低样品前处理时的稀释倍率。
Q:配置好的Working Solution能否保存?
A:配置好的Working solution无法保存,请现配现用。另外,Working solution遇光不稳定,配制好后请用铝箔纸包裹避光。※避光、室温的条件下可保存2小时左右。
Q:检测样品是否可以保存?
A:操作说明书上的“—定量细胞内α-KG的样品制备—”的步骤5中得到的前处理样品在-20℃可以保存10天。冷冻保存后的样品会发生沉淀,请离心后取上清作为检测样品。※加入20 μl Lysis solution, 吹打混匀后8,000xg离心10 min,取上清。
Q:是否有组织样品的检测实例?
A:有小鼠肝脏组织的检测实例。

具体的实验步骤如下:

 

碱性提取法提取的肝脏样品中的代谢指标检测

 

1.取大约100 mg小鼠肝脏组织样品加至500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液中。

※必须使用经过灌流操作完全脱血的组织样品,否则残留的血液会影响检测结果。

2.用Dounce型组织研磨器研磨肝脏组织。

3.将研磨后的样品回收至微管中,用500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液清洗研磨器,并将清洗后的液体也

一起转移到回收样品的微管中(共约1 ml)。

4.向回收样品的微管中加入1 ml预冷的超纯水,充分混合后在冰浴上静置5 min(共约2 ml)。

※由于溶液的粘性较高,有时会出现离心后难以分离的情况。此时,用25 g左右的细针头注射器不断

吸取/推出(大约20-30次),直到可以顺畅的吹打溶液为止。

5.离心机12,000xg,4 ℃离心5 min。

α-KG检测用样品的制备

 

6.取900μl上一步操作(步骤5)得到的溶液,加入200μl 1mol/l KH2PO4水溶液进行中和,混匀后在冰浴上

静置5 min。

7.离心机12,000xg,4 ℃离心5 min,取1 ml上清液至新的微管中作为检测样品。

 

<检测时的注意事项>

※组织提取的样品无法保存,请在当天内完成检测。

※枪头中残留的样品溶液时造成误差的原因之一,吸取样品溶液时尽量缓慢,减少枪头中残留的样品溶液。

※在稀释标准品和样品的时候,使用0.5 mol/l KOH水溶液和1mol/l KH2PO4水溶液按照9:5比率混合的溶液。

 

<检测实例>

诱导非酒精性脂肪肝的小鼠肝脏组中α-KG量的变化

1648777907404487.png

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256
乳酸检测试剂盒
Lactate Assay Kit-WST
商品信息
储存条件:0-5度保存,避光
运输条件:室温

特点:

 

● 细胞上清液和细胞样品均适用

● 操作简便

● 灵敏度高最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸

● 试剂稳定性高

● 享有显色底物WST专利

下载说明书
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葡萄糖乳酸检测
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代谢检测方案
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试剂盒内含
概述
原理
特点
乳酸标准曲线
实验例
常见问题Q&A
参考文献

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试剂盒内含

image.png

概述

乳酸是细胞的一种主要代谢途径-糖酵解的代谢产物,也是肌肉疲劳和高乳酸血症的重要生物标志物。它还可以作为监测细胞内代谢途径变化的标志物。此外最近的代谢研究表明,乳酸是组织和癌细胞的三羧酸循环中碳的主要来源。

Lactate Assay Kit-WST®可用于定量检测糖酵解代谢产生的乳酸,并优化了定量过程。本试剂盒通过测定WST®的显色反应来定量细胞上清液中的乳酸含量,可用96孔板检测,灵敏度高,最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸。

WST®:WST是日本同仁化学研究所的注册商标

原理

本试剂盒通过测定WST的显色反应来定量细胞上清或细胞内的乳酸含量。

另外,试剂盒中含有乳酸标准液,可以通过制备标准曲线来定量样品中的乳酸浓度。

image.png

特点

特点1:操作简单,只需要加入试剂

只需在加入细胞裂解液的细胞上清液中加入试剂,培养即可。

1622509569511608.jpg

特点2:试剂稳定性高

1622509609938735.jpg

乳酸标准曲线

可以从使用试剂盒中的乳酸标准液制作出乳酸标准曲线,然后通过标准曲线求出样品中的乳酸浓度。

当乳酸浓度在1 mmol/l以上时,可以通过稀释样品进行检测。

image.png

实验例

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用 

1、在96孔板中接种1×104个/孔的HeLa细胞(MEM培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素),在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

2、去除上清液后,在培养基中加入100 µl配制好的系列浓度的2-脱氧-D-葡萄糖溶液。

3、在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

4、培养后,吸取20 µl细胞上清液至1.5 ml微量管中,并用超纯水稀释8倍制备样品溶液,然后按照说明书的图3在每孔中加入20 µl样品溶液。

5、按照“配制乳酸标准液”的方法配制乳酸标准液。

6、在96孔板中按照说明书的图3在每孔中加入20 µl各种浓度的乳酸标准液。

7、在每孔中加入80 µl工作液。

8、在37℃培养箱中培养30 min。

9、用酶标仪测定450 nm的吸光度,并用标准曲线计算样品的乳酸浓度。

image.png

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用,随着2-脱氧-D-葡萄糖 (一种糖酵解抑制剂)浓度的增加,乳酸浓度逐渐减少

葡萄糖和乳酸的测定例

用葡萄糖测定试剂盒(货号:G264)和乳酸测定试剂盒检测(货号:L256):检测将葡萄糖转运蛋白抑制剂Phloretin添加到Jurkat细胞时的代谢活性变化。

 

1622509674875319.jpg

■实验条件

细胞:Jurkat细胞(5×105细胞)

药物:Phloretin(终浓度:100 µmol/l)

培养时间:过夜培养

■结果

Phloretin的添加抑制了葡萄糖的摄取,减少了葡萄糖的消耗,增加了培养基中葡萄糖的量,并减少了乳酸的量。

常见问题Q&A

Q:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸吗?
A:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸。
但是在含有血清的情况下,由于背景上升,需要测定培养基OD值并将其作为背景对照减去。
【参考数据】
含和不含10%FBS的吸光度比较

1622509903121990.jpg

<结果>
在培养基中加入10%FBS的组吸光度大大升高,因此需要测定培养基作为背景对照。

Q:如何检测细胞内乳酸含量?
(1)用微量管收集1×105的细胞*1

(2)以300×g离心2 min后去除上清液。

(3)加入300 μl的PBS,用移液器吹打使其重悬,再以300×g离心2 min后去除上清液。
(4)加入300 μl细胞裂解液*2(0.1%Triton-X)并涡旋1 min,制成细胞裂解液。

(5)以8000×g离心5 min,收集上清液。
(6)将步骤(5)所得溶液用超滤离心管(PALL,No.OD010C3,滤膜分子量:10K)以12,000×g 离心10 min*3去除蛋白质,得到待测样品。

*1、样品为HeLa细胞时,为了检测出0.02 mmol/l以上的乳酸含量,需要1×105的细胞甚至更多。
*2、如果细胞裂解液中含有SDS会抑制显色,因此不要使用含有SDS的缓冲液。

*3、内源性乳酸脱氢酶(LDH)会导致背景增高,因此通过脱蛋白处理去除内源性乳酸脱氢酶

(LDH)。
※测定样品设定为3个复孔时(n=3),合计至少需要60 μl以上(每孔20 μl×3)。
※如果过滤后滤液不足60 μl,可适当延长过滤时间。
※稀释细胞裂解液至合适的浓度,使结果在标准曲线范围内(0-1 mmol/l)。

Q:配制后的Working   Solution稳定性如何,可以保存多久?
A:Working Solution需要现配现用。
光会影响Working Solution的稳定性,所以配制后请用铝箔纸包裹。
配制后的Working Solution在室温避光条件下可以保存4 h。
(Working Solution遇到光,溶液的颜色会由红色变为橙色,背景会升高。)
Q:为什么我的样品孔没有显色?
A:样品中的乳酸浓度可能低于检测限(0.02 mmol/l)。
乳酸浓度低于0.02 mmol/l的样品无法用该试剂盒检测,因此请考虑其他方法,如LC-MS。
如果待测样品被稀释,则稀释样品中含有的乳酸浓度可能低于0.02 mmol/l。
请降低稀释比例,从而将检测样品的乳酸浓度调整到最低检测限以上。
Q:是否可以检测含有还原性物质的样品?
A:如果样品中含有还原性的物质,则WST染料也会发生显色,此时无法准确定量乳酸浓度。
实验中如遇到以上情况,可以设定药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂),
并将标准品孔和样品孔的吸光度分别减去药物对照的吸光度。
Q:该试剂盒可以定量D-Lactate吗?
A:该试剂盒是用于L-Lactate的定量,不能定量D-Lactate。
Q:是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测?
A:也可以使用490 nm的滤光片, 但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。
Q:一个试剂盒可以检测样品的数量。
A:制备标准曲线和样品(n=3)时,可以检测的样品数量如下所示。

1622509930424476.jpg

标准曲线:8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

L256-96孔板示意图3.jpg

96孔板排列示意图(n=3)

参考文献

编号 文献名 年分 IF
1 Hypoxia-induced   exosomal circPDK1 promotes pancreatic cancer glycolysis via c-myc activation   by modulating miR-628-3p/BPTF axis and degrading BIN1 2022 23.2
2 Serine   racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from   serine 2020 19.9
3 YAP   mediates compensatory cardiac hypertrophy through
aerobic glycolysis in response to pressure overload
2022 19.5
4 Serine   racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from   serine,
Nature Metabolism,2020, 2,81–96
2020 13.5
5 Polymer-conjugated   glucosamine complexed with boric acid shows tumor-selective accumulation and   simultaneous inhibition of glycolysis, Biomaterials,2021, 269:120631 2020 12.8
6 Metabolome   Analysis Reveals Excessive Glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK   Signaling in Methotrexate-Resistant Primary CNS Lymphoma-Derived Cells,   Clinical Cancer Research,2020, 26(11):2754-2766 2020 11.2
7 Inhibition   of glycolytic activator PFKFB3 suppresses tumor growth and induces tumor   vessel normalization in hepatocellular carcinoma 2021 9.8
8 Epigenetic silencing   of LncRNA LINC00261 promotes c-myc-mediated aerobic glycolysis by regulating   miR-222-3p/HIPK2/ERK axis and sequestering IGF2BP1 2021 8.8
9 PLEKHA5   regulates the survival and peritoneal dissemination of diffuse-type gastric   carcinoma cells with Met gene amplification, Oncogenesis,2021, 10(3):25 2021 7.5
10 An iPSC-based neural   model of sialidosis uncovers glycolytic impairment-causing presynaptic   dysfunction and deregulation of Ca2+ dynamics 2021 7.1
11 Tumor   cell-derived angiopoietin-like protein 2 establishes a preference for   glycolytic metabolism in lung cancer cells,Cancer Science,2020,   111(4):1241-1253 2020 6.7
12 Tumor cell-derived   angiopoietin-like protein 2 establishes a preference for glycolytic   metabolism in lung cancer cells 2020 6.5
13 Sodium-Glucose   Co-Transporter 2 Inhibitors Correct Metabolic Maladaptation of Proximal   Tubular Epithelial Cells in High-Glucose Conditions 2020 6.2
14 Metabolites Produced   by a New Lactiplantibacillus plantarum Strain BF1-13 Isolated from Deep   Seawater of Izu-Akazawa Protect the Intestinal Epithelial Barrier from the   Dysfunction Induced by Hydrogen Peroxide 2022 6.1
15 MicroRNA-505,   Suppressed by Oncogenic Long Non-coding RNA LINC01448, Acts as a Novel   Suppressor of Glycolysis and Tumor Progression Through Inhibiting HK2   Expression in Pancreatic Cancer 2021 6.1
16 Matrine   Promotes Human Myeloid Leukemia Cells Apoptosis Through Warburg Effect   Mediated by Hexokinase 2, Frontiers in Pharmacology,2019, 10:1069 2019 5.8
17 Mutant KRAS drives   metabolic reprogramming and autophagic flux in premalignant pancreatic cells 2021 5.8
18 Long Non-Coding RNA   TMPO-AS1 Promotes GLUT1-Mediated Glycolysis and Paclitaxel Resistance in   Endometrial Cancer Cells by Interacting With miR-140 and miR-143 2022 5.7
19 Circ_0002111/miR-134-5p/FSTL1   signal axis regulates tumor progression and glycolytic metabolism in   papillary thyroid carcinoma cells 2022 5.5
20 SIRT3-Mediated   SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells,   Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732 2021 5.3
21 Metabolic changes in   synovial cells in early inflammation: Involvement of CREB phosphorylation in   the anti-inflammatory effect of 2-deoxyglucose 2021 4.1
22 Novel   pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib   on the lactate dehydrogenase pathway, Biochemical and Biophysical Research   Communications,2019, 510(4):501-507 2019 3.6
23 Neopetrosidines   A–D, pyridine alkaloids isolated from the marine sponge
Neopetrosia chaliniformis and their cell cycle elongation activity
2021 3.5
24 Novel pharmacological   effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate   dehydrogenase pathway 2019 3.3
25 Circ_0000442   functions as a tumor repressor in breast cancer by impacting miR-1229-3p and   upregulating ZBTB1 2020 2.5
26 Suppressive Effects   of Anisomycin on the Proliferation of B16 Mouse Melanoma Cells In Vitro 2021 2.1
27 Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration 2023 15.1
28 Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage 2023 4.6
29 Exosomes secreted by ST3GAL5high cancer cells promote peritoneal dissemination by establishing a premetastatic microenvironment 2023 6.6

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号:G264

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号:G264
葡萄糖检测试剂盒
Glucose Assay Kit-WST
商品信息
储存条件:0-5度保存,避光防潮
运输条件:室温

特点:

 

● 细胞上清液和细胞样品均适用

● 稳定性好

●可使用酶标仪高通量筛选

下载说明书
SDS下载
代谢宣传资料
葡萄糖乳酸检测
选择规格:
50 tests
200 tests
现货
代谢
Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒
产品解说
活动进行中
试剂盒内含
概述
原理
操作步骤
制作葡萄糖标准曲线
实验例
常见问题Q&A
参考文献

产品解说

 

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凑单关联产品TOP5

NO.1.    Lactate Assay Kit-WST     乳酸检测

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试剂盒内含

50 tests 200 tests
Dye Mixture ×1 ×1
葡萄糖标准品(10 mmol/l)(红盖) 150 μl×1 600 μl×1
酶(绿盖) ×1 ×1
Assay Buffer 3.5 ml×1 14 ml×1
Reconstitution Buffer(蓝盖) 350 μl×1 1.4 ml×1

概述

葡萄糖是一种提供体内能量来源的最重要的物质,也是一种主要能量代谢指标。它不仅是糖尿病和肥胖研究的糖代谢指标,在癌症研究中,也常和乳酸一起作为体内细胞代谢的检测指标。最新的研究表明,抑制与葡萄糖代谢和脂质代谢有关的酶的活性,可以抑制癌细胞的生长。

葡萄糖检测试剂盒(Glucose Assay Kit-WST)可以定量检测能量代谢的底物-葡萄糖,通过测定WST反应的吸光度来定量细胞培养基上清液中的葡萄糖。检测限可达浓度为0.02 mmol/l的葡萄糖,适合用96孔板检测,可以同时检测多个样品。

原理

*本试剂盒可以检测细胞上清液的葡萄糖的含量,通过检测WST甲赞的吸光度来测定。另外,试剂盒里有葡萄糖标准液,可以制作标准曲线,测定样品中的葡萄糖浓度。

1611274375398374.jpg

*要测定细胞上清液以外的样品,请事先查看常见问题FAQ“是否有检测细胞上清液以外的实验例?”。

操作步骤

1622183463721345.jpg

制作葡萄糖标准曲线

可以用试剂盒中的葡萄糖标准液制作出葡萄糖标准曲线,然后通过标准曲线求出样品中的葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度在0.5 mmol/l以上时,可以通过稀释样品进行检测。

1611287393532748.gif

实验例

用Phloretin抑制葡萄糖的摄取

1. 制备所需浓度Phloretin的Jurkat细胞悬液 (5×105 cells/ml,在RPMI培养基中含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素)。

2. 在6孔板中接种1×106 cells/孔的细胞悬液,在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

3. 将细胞悬液转移到锥形管中,在1,500 rpm离心5 min。

4. 吸取100 µl上清液至1.5 ml微型管中,用超纯水稀释30倍。

5. 按照葡萄糖标准液的制备方法制备葡萄糖标准液。

6. 在96孔板中分别加入50 µl的样品或葡萄糖标准液。

7. 在每孔中加入50 µl工作液。

8. 在37℃培养箱中培养30 min。

9. 用酶标仪检测450 nm处的吸光度,根据葡萄糖的标准曲线计算样品的葡萄糖浓度。

实验例1.jpg

Phloretin抑制葡萄糖的摄取

实验证实,细胞培养基上清液中的葡萄糖摄入量减少与Phloretin (一种葡萄糖转运抑制剂)浓度之间有依存关系。

常见问题Q&A

Q1:是否可以检测2-Deoxy-D-glucose?
A1:可以检测2-Deoxy-D-glucose。
Q2:Working Solution的稳定性如何?
A2:Working   Solution无法保存,请现配现用。由于对光不稳定,因此配制后请避光,在室温和避光条件下可保存4小时(当Working   Solution在曝光下,溶液颜色会由红色变为橙色,背景升高)。
Q3:当有还原性物质存在时是否还可以用这个试剂盒检测?
A3:如果样品中含有还原性的物质,则也会和WST染料发生显色,此时无法准确定量葡萄糖浓度。实验中如遇到以上情况,可以设定药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)作为背景对照,并从标准曲线和样品的吸光度中减去它。
Q4:是否有检测细胞上清液以外的实验例?
A4:有测定细胞内葡萄糖的实验例。操作详情,请参考常见问题FAQ“Q5”。其他的样品没有实验例。
Q5:是否可以检测细胞内葡萄糖?
A5:细胞内葡萄糖也可以检测,请参考下面的样品制备步骤。
 

请准备「0.1%Triton X-100水溶液」和「滤膜(分子量:10KD )」

(1)将细胞*1悬液收于1.5 ml微量管中。

※测定所需的细胞数,需要根据细胞种类进行调整。
HepG2细胞和Jurkat细胞的测量结果如下图所示
(2)在300×g下离心5分钟,去除上清液。
(3)加入300 µl PBS,重悬细胞,在300×g下离心5分钟,除去上清液。
(4)加入250 µl细胞溶解液*2(0.1%Triton-X),裂解细胞后,在12,000×g离心5分钟。
(5)将操作(4)的上清液200 µl转移到超滤膜过滤管(分子量:10K)中,以12,000×g离心10分钟。
※当测定样品为n=3时,总共需要150 µl以上(50 µl×3)。
※离心后的滤液不超过150 µl时,请延长离心时间。
(6)将通过操作(5)得到的滤液作为测定样品。
然后按照使用说明书,测定葡萄糖浓度。
※测定试样在标准曲线范围内(0-0.5 mmol/l)内,请适当用细胞溶解液稀释,用于测定。
*1 为了检测0.02 mmol/l以上的葡萄糖,HepG2细胞数量为1×105cells以上,Jurket细胞需要2×106 cells以上的细胞数量。
*2 细胞溶解液中含有SDS会抑制显色,因此不能使用含有SDS的缓冲液。

 

Q6:一个试剂盒可以检测样品的数量。
A6:制备标准曲线和样品(n=3)时,可以检测的样品数量如下所示。

样品数.jpg

标准曲线:8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

image.png

96孔板排列示意图(n=3)

Q7:可以测量L-Glucose吗?
A7:本产品用于β-D-Glucose测量,不能测量L-Glucose。

参考文献

No 检测对象 文献
1 小鼠血清 Increased levels of Aβ42 decrease the lifespan of ob/ob mice with dysregulation of microglia and astrocytes, FASEB   J., 2019,DOI: 10.1096/fj.201901028RR
2 链霉菌 Enhancement of metabolic flux toward ε-poly-l-lysine biosynthesis by targeted inactivation of concomitant polyene macrolide biosynthesis in Streptomyces albulus, J. Biosci.Bioeng., 2020,DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.12.002
3 HCT116细胞 Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine, Nat. Metab., 2020, 2(1), 81
4 P388白血病细胞 2-Deoxy-D-glucose enhances the anti-cancer effects of idarubicin on idarubicin-resistant P388 leukemia cell, Oncol. Lett., 2020, 20(1), 962-966
5 小鼠精子细胞 Macrophage ubiquitin‑specific protease 2 contributes to motility, hyperactivation,   capacitation, and in vitro fertilization activity of mouse sperm, Cellular and Molecular Life Sciences, 2020, doi:   10.1007/s00018-020-03683-9

 

*要测定细胞培养上清液以外的样品,请事先查看常见问题FAQ“是否有除检测细胞上清液以外的样品检测实验例”。

Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒-Green货号:UP02

Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒-Green货号:UP02
葡萄糖摄取检测试剂盒
葡萄糖代谢、葡萄糖摄取
商品信息
储存条件:0-5°C
运输条件:常温

特点:

 

● 检测灵敏度高

● 操作简便,用时短

● 可以用荧光酶标仪做高通量筛选

● 荧光染料泄露少,数据重现性高

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葡萄糖摄取检测
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与传统法的比较
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产品概述

细胞通过摄入各种各样的营养物质并在胞内的代谢作用下产生能量。营养物代谢的过程随着细胞外环境、细胞状态、细胞种类的不同亦不尽相同。近年来的研究发现,营养代谢不仅与能量的产生密切相关,还与基因表达等各种各样的细胞调节机制有关。葡萄糖是最重要的一种营养物质,细胞摄取葡萄糖的过程对于研究和理解细胞机能非常重要。细胞摄取葡萄糖的评价方法主要是放射性同位素示踪法。但是由于放射性同位素示踪法操作繁杂,泛用性并不高。另外,还有一种使用2-Deoxy-D-glucose(2-DG)的酶循环法,该方法虽然可以进行孔板检测,但是无法用于荧光显微镜和流式细胞仪观察。因此,最近常用的方法是通过葡萄糖类似物2-NBDG的荧光检测法1)。然而,2-NBDG也有荧光强度弱、灵敏度低的问题,而且被细胞摄取的2-NGDG还有从细胞中向外泄漏的情况出现。同仁化学研究新开发的荧光葡萄糖类似物Glucose Uptake Probe-Green是一种比2-NBDG灵敏度更高的葡萄糖摄取能力检测试剂。而且使用本试剂盒中包含的Washing and Imaging (WI) Solution可以抑制探针从细胞内泄漏,得到重现性更高的实验数据。

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产品优势

与传统方向相比的优势! 4大特征

由于采用高亮度的荧光染料,相较于传统方法(2-NBDG)可以在更短时间内进行高灵敏度检测。

① 高灵敏度

2-NBDG在水中的荧光强度很低,而本试剂盒采用的荧光染料可以进行高灵敏度的葡萄糖摄取能力检测。

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<观测条件>

细胞: A549细胞

检测仪器:荧光显微镜

检测滤光片:GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)

② 快速检测

使用高亮度的Glucose Uptake Probe-Green,即使使用2-NBDG完全相同的实验步骤,也可以大幅缩短实验时间。

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操作的前处理、染色(进入细胞内的过程)的步骤只需要清洗3次,非常简便

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③  荧光酶标仪的多样品检测

2-NBDG很难用于荧光酶标仪的检测,而本试剂盒可用于荧光酶标仪的高通量筛选实验。

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<检测条件>

细胞:A549细胞

Ex: 488 nm; Em: 520 nm

④  减少荧光染料的泄漏

使用试剂盒附带的WI Solution清洗细胞,可以抑制染料进入细胞后的泄漏,得到重现性更高的数据。

使用HBSS清洗细胞时

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使用WI Solution清洗细胞时

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(Scale Bar: 50 μm)

<观测条件>

细胞:A549细胞

检测仪器:荧光显微镜

检测滤光片:GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)

与传统法的比较

        Glucose Uptake Probe-Green和2-NBDG都可以用于荧光显微镜和流式细胞仪的检测。而相比较于2-NBDG的激发波长,Glucose Uptake Probe-Green对于488 nm的激发光以及GFP, FITC滤光片的适用度更高。

产品名 荧光

显微镜

荧光

酶标仪

流式

细胞仪

染料滞留时间 荧光特性
Glucose Uptake Assay Kit-Green 1 h※ λex: 507 nm, λem: 518 nm
2-NBDG × 30 min以下※ λex: 465 nm, λem: 540 nm

※A549细胞的检测结果,不同的细胞种类,染料的滞留时间可能会有差异。

相关产品区别

与Glucose Assay Kit的不同点

Glucose Uptake Probe-Green和Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)的不同点。

1.Glucose Assay Kit-WST可以定量检测细胞上清液中葡萄糖的消耗量。

Glucose Uptake Assay Kit无法定量检测葡萄糖。

2.Glucose Uptake Assay Kit-Green可短时间内检测葡萄糖摄取能力的差值。

Glucose Assay Kit-WST无法在短时间内检测葡萄糖量的变化。

Glucose Assay Kit-WST与本试剂盒的差别,通过下面的检测实例来说明。

实验例:用葡萄糖摄取抑制剂(Cytochalasin B)处理的HepG2细胞的葡萄糖消费量和葡萄糖摄取能力的检测。

实验的流程和检测结果:

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实验例

实验例1:Cytochalasin B对葡萄糖摄取的抑制作用

HepG2细胞经过葡萄糖转运蛋白抑制剂Cytochalasin B处理后,使用本试剂盒对葡萄糖摄取能力的抑制作用进行高灵敏度观察以及数值化的检测。

荧光显微镜观察

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(Scale Bar: 50 μm)

<观测条件>

细胞:HepG2细胞

使用培养基:MEM (5.5 mmol/l Glucose)

培养条件:5 µmol/l Cytochalasin B / MEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS), 37℃, 24 h

染色条件:Glucose Uptake Probe (500倍稀释)/DMEM (0 mol/l Glucose), 37℃, 15 min

检测仪器:荧光显微镜; 滤光片:GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)

荧光酶标仪

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<检测条件>

Ex: 488 nm; Em: 520 nm

实验例2:Insulin(胰岛素)对细胞葡萄糖摄取能力的促进

胰岛素对脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力的影响通过本试剂盒进行高灵敏度检测。

荧光显微镜观察

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(Scale Bar: 50 μm)

<观测条件>

细胞:mouse adipocyte

使用培养基:DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)

刺激条件:0 or 1 µmol/l Insulin / DMEM (0 mmol/l Glucose , serum free), 37℃, 15 min

染色条件:Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min

检测仪器:荧光显微镜; 滤光片:GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)

荧光酶标仪检测

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<检测条件>

Ex: 488 nm; Em: 520 nm

※由于脂肪细胞的特性,很难在孔板上均匀分布,所以实验数据会有一些孔间差。

<实验操作>

1.脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中,过夜培养。

2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后,加入不含葡萄糖的培养基(0 or 1 μmol/l Insulin)。

3.在37℃下培养15 min。

4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution, 37℃下培养15 min。

5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后,再次添加WI Solution(4℃)。

6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。

实验例3:前脂肪细胞和细胞脂肪细胞的葡萄糖摄取能力的比较

使用本试剂盒对前脂肪细胞(preadipocyte)和脂肪细胞(adipocyte)的葡萄糖摄取能力进行高灵敏度检测。

荧光显微镜观察

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(Scale Bar: 50 μm)

<观测条件>

细胞:preadipocyte, adipocyte

使用培养基:DMEM (5.5 mmol/l Glucose, 10% FBS)

染色条件:Glucose Uptake Probe-Green (500倍稀释) /DMEM (0 mmol/l Glucose, serum free), 37℃, 15 min

检测仪器:荧光显微镜; 滤光片:GFP (Ex: 470 /40 nm; Em: 525 /50 nm)

荧光酶标仪检测

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<检测条件>

Ex: 488 nm; Em: 520 nm

※由于脂肪细胞的特性,很难在孔板上均匀分布,所以实验数据会有一些孔间差。

<实验操作>

1.前脂肪细胞和脂肪细胞分别接种到不同的ibidi 96孔板中,过夜培养。

2.用不含葡萄糖的DMEM培养基清洗细胞2次后,加入不含葡萄糖的培养基。

3.在37℃下培养15 min。

4.加入用不含葡萄糖的培养基500倍稀释的Probe solution, 37℃下培养15 min。

5.用预冷至4℃的WI Solution(1x)清洗3次后,再次添加WI Solution(4℃)。

6.分别用荧光显微镜和荧光酶标仪检测。

 

实验例4:饥饿培养引起的细胞自噬和葡萄糖摄取变化

用自噬体染料DAPRed和自噬溶酶体染料DALGreen染色HeLa细胞后,用不含氨基酸的培养基培养3小时诱导细胞自噬。通过DAPRed和DALGreen的荧光强度增高确认细胞发生了细胞自噬,另外通过使用Glucose Uptake Probe-Blue发现细胞摄取葡萄糖的能力上升。

微信截图_20211209152737.png

(Scale Bar: 50 μm)

 

<检测条件>

荧光显微镜

Blue: Ex = 340-380 nm, Em = 435-485 nm

Green: Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm

Red: Ex = 533-557 nm, Em = 570-640 nm

常见问题Q&A

Q1: Glucose Uptake Probe-Green具体是通过哪种葡萄糖转运蛋白进入细胞的?
A:对于具体的每一种葡萄糖转运蛋白的特异性目前还没有详细的数据。
Q2:目前有过检测实例的细胞有哪些?
A:目前的检测实例细胞系请参考下表:
细胞种类 Probe stock solution

的稀释倍率

染色时间
人肺腺癌细胞 A549 x 500 15 min
人肝癌细胞 HepG2 x 500 15 min
前脂肪细胞 preadipocyte(3T3-L1) x 500 15 min
脂肪细胞 adipocyte(3T3-L1) x 500 15 min
恶性黑色肿瘤细胞 MO5 x 500 15 min
小鼠成肌细胞 C2C12 x 500 5 min
人星形胶质瘤细胞 U-251 MG x 500 15 min
人子宫颈癌细胞 HeLa x 500 15 min
小鼠肺癌细胞 3LL x 50000 15 min
T细胞 CD4+ T cell x 50, x500 15 min
小鼠巨噬细胞 J774.1 x 500 15 min
线虫 N2 x 500 90 min
Q3:Glucose Uptake Probe-Green被细胞摄入后,会被分解或代谢掉吗?
A:染料的荧光部分非常稳定,实验范围内的操作不会造成分解。另外,类葡萄糖的部位,从结构上考虑可能会被Hexokinase(己糖激酶)磷酸化,除此以外应该不会参加任何代谢反应。
Q4:Glucose Uptake Probe-Green被活细胞摄入后,可以进行细胞固定的操作吗?
A:由于荧光探针会从细胞内漏出,染色后无法进行细胞固定。
Q5:用荧光酶标仪检测时候,对孔板有什么特别要求吗?
A:需要使用荧光检测用的细胞培养板。
Q6:Probe working solution可以长期保存吗?
A:Probe working solution无法长期保存,请现配现用。Probe stock solution冷冻可以保存一个月。
Q7:无法观察到荧光信号变化的时候,应该怎么办?
A:预实验的时候可以先从稀释浓度(x250~x1,000)、染色时间(5 min~1 h)范围内进行摸索。
Q8:荧光背景高的时候,应该怎么办?
A:可能是由于有未被细胞摄入的残留荧光染料。请用WI Solution再多进行一次清洗操作。
Q9:Glucose Uptake Probe-Green对细胞有毒性吗?
A:使用同仁化学研究所的Cell Counting Kit-8(货号:CK04)对A549细胞的Glucose Uptake Probe-Green细胞毒性进行了检验,没有发现细胞毒性的产生。
Q10:用WI solution清洗之后,荧光染料可以在细胞内停留多长时间?
A:一般在室温下可以保持在细胞内1 h左右,不同的细胞种类,时间可能会有一定差别。
Q11:可以对葡萄糖进行定量检测吗?
A:本产品不能用于葡萄糖的定量检测。如果需要定量检测培养基中的葡萄糖的消耗量或者细胞内的葡萄糖量,可以使用同仁化学研究所的Glucose Assay Kit-WST(货号:G264)。

 

Q12:可以对被细胞摄入的染料进行定量吗?
A:不可以对细胞摄入的染料进行定量。本试剂盒是葡萄糖摄取能力强弱或增减的检测试剂盒。
Q13:如果无法通过葡萄糖的竞争性抑制细胞探针的摄取,该如何解决?
A:竞争性抑制是否发生取决于每个细胞中的葡萄糖转运蛋白的表达水平和类型。(例如:HepG2细胞)图片1.jpg

在这种情况下,使用2-脱氧葡萄糖(2-DG)进行预处理可能会在葡萄糖竞争抑制方面产生差异。 请参考Glucose Uptake Assay Kit-Green(产品代码:UP02)的使用示例。

2-DG预处理对探针摄取的抑制和葡萄糖竞争性抑制(HepG2细胞)

1.将细胞接种在培养皿或微孔板中,并在5% CO₂培养箱(37°C)中培养过夜。

2.除去培养基[DMEM (10% FBS,高葡萄糖)]后,加入50 mmol/l 2-DG/培养基,并 在5% CO₂培养箱(37℃)中培养细胞2小时。

3.清洗细胞两次。

4.加入预热的DMEM(无葡萄糖,无血清)并将细胞在5%CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。

5.除去上清液后,加入预热的探针溶液并在5% CO₂中孵育 在培养箱(37°C)中培养15 min。

6.除去上清液后,用冷却的WI溶液(1x)洗涤细胞两次。

7.除去上清液后,加入冷却后的WI溶液(1x),并在室温下培养 5分钟。

8.除去上清液后,加入冷却的WI溶液(1x)。

9.荧光显微镜下观察细胞。

图片3.jpg

Q14: 以下为不同细胞添加抑制剂后,葡萄糖摄取能力检测实验。
02.png

规格性状

            Glucose Uptake Probe-Green  ×1

WI Solution (50X)   5 ml ×1

供参考的可测次数

每个试剂盒大约可检测12枚35 mm dish或1枚96孔板

参考文献

编号 文献 IF
1 Enhanced   aerobic denitrification performance with Bacillus licheniformis via secreting   lipopeptide biosurfactant lichenysin, Chemical Engineering   Journal,2022,434:134686 2022 13.3
2 Genetically   engineered probiotics as catalytic glucose depriver for tumor starvation   therapy 2023 10.8
3 Remodeling   on adipocytic physiology of organophosphorus esters in mature adipocytes 2022 9.9
4  Simple Fluorescence Assay for Cystine Uptake   via the xCT in Cells Using Selenocystine and a Fluorescent Probe, ACS   Sensors,2021, 6(6):2125-2128 2021 7.7
5 N-Caffeoyltryptophan   enhances adipogenic differentiation in preadipocytes and improves glucose   tolerance in mice 2023 3.7