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Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色

发表于由
Nucleolus Bright Red试剂货号：N512
核仁荧光染色试剂-红色
Nucleolus Bright Red
商品信息
储存条件：冷暗处保存
运输条件：室温

特点：

 

● 高特异性核仁定位

● 可通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

● 两种颜色可供选择

下载说明书
选择规格：
60 nmol
现货
 
衰老检测方案
活动进行中
活动进行中
荧光特性
产品概述
原理
核仁染色试剂的比较
产品特点
衰老细胞的评价例
产品实验例
核仁数分析
常见问题Q&A
产品文献

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指标 关联指标干货参考（点击查看） 检测指标（点击查看）
DNA损伤检测
 γ-H2AX DNA损伤检测试剂盒- γH2AX（绿、红、深红）
AP位点 DNA损伤检测试剂盒（AP位点法）
核小体 Nucleolus Bright (绿、红）
细胞周期 Cell Cycle Assay Kit – PI/RNase Staining
DNA损伤关联指标 氧化损伤 DMPO
BMPO
TEMP
SOD Assay Kit
DPPH Antioxidant Assay Kit
凋亡 Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit/PI
Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit/PI
Cell Cycle Assay Solution Deep Red/Blue
JC-1 MitoMP Detection Kit
Caspase-3 Assay Kit
铁死亡 Lipid Peroxidation Probe -BDP 581/591 C11
Liperfluo
GSSG/GSH Quantification Kit II
Iron Assay Kit
Mito-FerroGreen
衰老 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal
Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal
SPiDER-βGal
自噬 Mitophagy Detection Kit
DALGreen – Autophagy Detection
DAPGreen – Autophagy Detection
DAPRed – Autophagy Detection

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荧光特性

1607065982812396.png

产品概述

Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

原理

核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。

1622192902845747.png

核仁染色试剂的比较

最大激发波长 最大发射波长 MeOH固定后染色 PFA固定后染色 活细胞染色
Nucleolus Bright Green 513 nm   538 nm 〇 〇 △※
Nucleolus Bright Red 537 nm 605 nm 〇 〇 △※

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。

产品特点

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

1622192822119035.png

<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

 

<检测条件>

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

1608620937494572.png

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

特点:3：与核仁相关的领域的报告示例

相关领域 概要 文献
评论(衰老）    关于各种参与细胞功能的核仁，
包括与癌症和早老症的已知关系、
特别是关于衰老的核仁功能。		 V. Tiku, A.   Antebi, “Nucleolar Function in Lifespan Regulation.”, Trends Cell Biol.,   2018, 28(8), 662.
细胞衰老    由于与抑制衰老有关的蛋白质缺损、
核仁数量的减少和核仁总面积的加。		 H. Tanaka,   S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M.   Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent   Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep.,2017, 18(9), 2148.
细胞衰老     由于rRNA加工因子的枯竭导致
核仁肥大化，
同时SA-βGal和p16表达增加。		 K.   Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, N. Katagiri, M. Tsuchiya, N. Goto, R.   Furumai, A. Murayama, J. Yanagisawa, K. Kimura, “Perturbation of ribosome   biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53   activation.”, Cell Rep., 2015, 10(8), 1310.
自噬    通过抑制RNA聚合酶的转录，
确认自噬的诱导和核仁的形状变化。		 N. Katagiri,   T. Kuroda, H. Kishimoto, Y. Hayashi, T. Kumazawa and K. Kimura, “The   nucleolar protein nucleophosmin is essential for autophagy induced by   inhibiting Pol I transcription”, Scientific Reports, 2015, 8903, DOI:   10.1038/srep08903.

衰老细胞的评价例

将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或

Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。

1608621093791795.png

<染色条件>

细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

产品实验例

实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。

将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

通过图像对核仁进行分析

用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。

1613715296471660.png

横河电机CQ1拍摄条件

使用板：96孔板

物镜：40倍

激发波长：

405nm（DAPI）：蓝色

488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色

视野：16视野

<解析图像>

蓝框线：核

红框线：核仁

核仁数分析

在传代数较多的细胞中，得到了1个细胞核中只有1个核仁的比例增加，而2个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)*2得到了相同的结果。

1606358872798301.png

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.

*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

常见问题Q&A

Q1：可以染色活细胞吗？
A1：本试剂建议用于固定细胞染色，不建议用活细胞染色。如果您想用活细胞染色，请联系我们的技术支持。

产品文献

1、T. Miki, T. Nakai, M. Hashimoto, K. Kajiwara, H. Tsutsumi and H. Mihara, “Intracellular artificial supramolecules based on de novo designed Y15 peptides”, Nat. Comm., 2021, doi:10.1038/s41467-021-23794-6.

2、T. Nozaki and S. Shigenobu, “Ploidy dynamics in aphid host cellsharbor ing bacterial symbionts”, Sci. Rep., 2022, doi:10.1038/s41598-022-12836-8.

Nucleolus Bright Green试剂货号：N511 核仁荧光染色试剂-绿色

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核仁荧光染色试剂-绿色
Nucleolus Bright Green
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指标 关联指标干货参考（点击查看） 检测指标（点击查看）
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DNA损伤关联指标 氧化损伤 DMPO
BMPO
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Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal
SPiDER-βGal
自噬 Mitophagy Detection Kit
DALGreen – Autophagy Detection
DAPGreen – Autophagy Detection
DAPRed – Autophagy Detection

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产品概述

Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

原理

核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。

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核仁染色试剂的比较

最大激发波长 最大发射波长 MeOH固定后染色 PFA固定后染色 活细胞染色
Nucleolus Bright Green 513 nm 538 nm 〇 〇 △※
Nucleolus Bright Red 537 nm 605 nm 〇 〇 △※

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。

产品特点

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

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<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

 

<检测条件>

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

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＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

特点:3：与核仁相关的领域的报告示例

相关领域 概要 文献
评论(衰老）    关于各种参与细胞功能的核仁，
包括与癌症和早老症的已知关系、
特别是关于衰老的核仁功能。		 V. Tiku, A.   Antebi, “Nucleolar Function in Lifespan Regulation.”, Trends Cell Biol.,   2018, 28(8), 662.
细胞衰老    由于与抑制衰老有关的蛋白质缺损、
核仁数量的减少和核仁总面积的加。		 H. Tanaka,   S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M.   Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent   Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep.,2017, 18(9), 2148.
细胞衰老     由于rRNA加工因子的枯竭导致
核仁肥大化，
同时SA-βGal和p16表达增加。		 K.   Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, N. Katagiri, M. Tsuchiya, N. Goto, R.   Furumai, A. Murayama, J. Yanagisawa, K. Kimura, “Perturbation of ribosome   biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53   activation.”, Cell Rep., 2015, 10(8), 1310.
自噬    通过抑制RNA聚合酶的转录，
确认自噬的诱导和核仁的形状变化。		 N. Katagiri,   T. Kuroda, H. Kishimoto, Y. Hayashi, T. Kumazawa and K. Kimura, “The   nucleolar protein nucleophosmin is essential for autophagy induced by   inhibiting Pol I transcription”, Scientific Reports, 2015, 8903, DOI:   10.1038/srep08903.

衰老细胞的评价例

将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或

Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。

1608621093791795.png

<染色条件>

细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

产品实验例

实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。

将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

通过图像对核仁进行分析

用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。

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横河电机CQ1拍摄条件

使用板：96孔板

物镜：40倍

激发波长：

405nm（DAPI）：蓝色

488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色

视野：16视野

<解析图像>

蓝框线：核

红框线：核仁

核仁数分析

在传代数较多的细胞中，得到了一个细胞核中只有一个核仁的比例增加，而两个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)*2得到了相同的结果。

blob.png

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.

*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

荧光特性

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常见问题Q&A

Q1：可以染色活细胞吗？
A1：本试剂建议用于固定细胞染色，不建议用活细胞染色。如果您想用活细胞染色，请联系我们的技术支持。

BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7

发表于由
BCECF-AM试剂货号：B262
3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester
CAS号：117464-70-7
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温
分子式：

C35H28O15

分子量：

688.59

特点：

 

● 水溶性好，可进入细胞膜

● 荧光强度高

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选择规格：
1mg
现货
荧光探针检测方案
活动进行中
规格性状
产品概述
产品特性
操作说明
文献

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凑单关联产品TOP5

NO.1.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.2.    Cell Counting Kit-8    细胞增殖毒性检测

NO.3.    Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST    乳酸脱氢酶(LDH)检测

NO.4.    Cell Viability Assay Kit    细胞增殖/毒性检测

NO.5.    Fluo 4-AM special packaging    细胞内钙离子检测

 

规格性状

规格

 

特性：该产物为浅橙色至浅橙色棕色粉末或固体，可溶于DMSO和乙腈。

纯度(HPLC)：90%以上

荧光光谱：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

BCECF被广泛地用于细胞内pH的测定。Tsien博士和其他人通过加入2个额外的羧化物基团改进了这种羧基荧光素。加入的两个羧基使得它能更好地被固定在细胞内。BCECF具有很好的水溶性，是因为它在中性pH时带有4-5个负电荷。但是BCECF却很难穿过细胞膜进入到细胞内。它的pKa值为6.97，高于其它的羧基荧光素。BCECF在激发光谱439nm处有等吸收点，因此它能和Fura 2一样可用比率法测定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率测量的波长，一般会将490nm和450nm的滤光片加在激发光源的前面。而530nm的滤光片则是用来查看它的荧光信号的。这里要注意的是激发光谱与吸收光谱有一些细微的区别。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能够轻易地进入到细胞内。就和其他的乙酰甲酯类一样，BCECF-AM只需要通过孵育就能进入细胞。BCECF-AM对潮湿非常敏感，所以要小心保存。如果DMSO储存液的颜色从浅黄色变为深橙色就代表了AM的分解。所以通过对颜色变化的观测，能判断AM酯的水解情况。

B262-1.gif

产品特性

BCECF-AM是一种对细胞内pH敏感的新型荧光探针，分别用490nm和440nm波长激发BCECF所得到的发射荧光之比与pH有很好的线性关系。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。BCECF-AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF-AM(pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

BCECF-AM(x600)-2.jpg

操作说明

试剂 (溶解方法):   

1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液(将1 mg 的BCECF-AM溶于1mlDMSO)HEPES缓冲液(20mM HEPES，153mM NaCl，5mM KCl，5mM glucose，pH7.4)

操作：

1.用HEPES制备细胞悬液，细胞浓度为4×107个/ml。

2.将1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液加入细胞悬液中 (细胞悬液的1/300体积)，BCECF-AM终浓度为3mM。

3.37℃培养30min。

4.用HEPES缓冲液清洗细胞3次，制成3×106个/ml的细胞悬液。

5.使用荧光显微镜或带有图像分析系统的激光共聚焦显微镜检测细胞的荧光强度。

*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

B262-3.png

文献

1.R.A.Steinhardt, et al.,Development of K+-conductance and Membrane Potentials in Unfertilized Sea Urchin Eggs After Exposure to NH4OH. Nature.1973;241:400-401.

2.T.J.Rink, et al.,Cytoplasmic pH and Free Mg2+ in Lymphocytes.J Cell Biol.1982;95:189-196.

3.A.M.Paradiso,et al.,Na+ -H+ Exchange in Gastric Glands as Measured with a Cytoplasmic-trapped, Fluorescent pH Indicator. PNAS.1984;81:7436-7440.

4.S.Grinstein,et al.,Phorbol Ester-induces Changes of Cytoplasmic pH in Neutrophils:Role of Exocytosis in Na+ – H+ Exchange.Am J Physiol.1985;248:C379-C386.

5.G.B.Zavoico, et al.,Regulation of intracellular pH in human platelets.Effects of thrombin,A23187,and ionomycin and evidence for activation of Na+/H+ exchange and its inhibition by amiloride analogs.J Biol Chem.1986;261:13160-13167.

6.G.R.Bright,et al.,Fluorescence Ratio Imaging Microscopy: Temporal and Spatial Measurements of Cytoplasmic pH.J Cell Biol.1987;104:1019-1033.

7.C.Aalkjaer,et al.,Intracellular pH Regulation in Resting and Contracting Segments of Rat Mesenteric Resistance Vessels. J Physiol.1988;402:391-410.

8.K.Tsujimoto,et al.,Intracellular pH of Halobacteria Can Be Determined by the Fluorescent Dye 2 E 7 Ebis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein.Biochem Biophys Res Commun.1988;155:123-129.

9.M.A.Kolber,et al.,Measurament of Cytotoxicity by Target Cell Release and Retention of the Fluorescent Dye Bis-carboxyethylcarboxyfluorescein(BCECF).J Immunol Methods.1988;108:255-264.

10.H.Harada,et al.,cAMP Activates Cl-/HCO3 – Exchange for  Regulation of Intracellular pH in Renal Epithelial Cells. Biochim Biophys  Acta. 1991;1092:404-407.11.C.C. Freudenrich, et al.,Intracellular pH Modulates  Cytosolic Free Magnesium in Cultured Chicken Heart Cells.Am J Physiol.1992;262:C1024-C1030.

12.K.Khodakhah,et al.,Functional Heterogeneity of Calcium  Release by Inositol Triphosphate in Single Purkinje Neurones, Cultured  Cerebellar Astorocytes, and Peripheral Tissues. PNAS. 1993;90:4976-4980.

13.G.Boyarsky,et al.,Superiority of in vitro Over in vivo Calibrations of BCECF in Vascular Smooth Muscle Cells. FASEB J.1996;10:1205-1212.

14.S.A. Weston,et al., New Fluorescent Dyes for Lymphocyte  Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy.J Immunol Methods.1990;133:87-97.

15.L.S.De Clerck,et al.,Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function.J Immunol Methods.1994;172:115-124.

FDA试剂货号：F209 Fluorescein diacetate

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FDA试剂货号：F209
Fluorescein diacetate
Fluorescein diacetate
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C24H16O7

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特点：

 

● 激发和发射波长分别为488 nm和530 nm

● 可用于流式细胞仪

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参考文献
常见问题Q&A

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特性：该产物为白色结晶粉末或固体，可溶于二甲基亚砜。

可溶于二甲基亚砜：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。由于荧光素较BCECF或Calcein的亲水性低，因此荧光素从细胞中渗漏的量也高。FDA也可用于流式细胞仪。荧光素的激发和发射波长分别为488 nm和530 nm。

荧光特性

荧光特性：λex=488 nm, λem=530 nm

参考文献

1) B. Rotman and B. W. Papermaster, “Membrane Properties of Living Mammalian Cells as Studied by Enzymatic Hydrolysis of Fluorogenic Esters”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, 55, 134.

2) H. R. Hulett, W. A. Bonner, J. Barrett and L. A. Herzenberg, “Cell Sorting: Automated Separation of Mammalian Cells as a Function of Intercellular Fluorescence”, Science, 1969, 166, 747.

3) K. H. Jones and J. A. Senft, “An Improved Method to Determine Cell Viability by Simultaneous Staining with Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide”,J.Histochem.Cytochem., 1985, 33, 77.

4) K. McGinnes, G. Chapman, R. Marks and R. Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”, J. Immunol. Methods, 1986, 86, 7.

5) W. M. J. Vuist, F. V. Buitenen, M. A. De Rie, A. Hekman, P. Ruemke and C. J. M. Melief, “Potentiation by Interleukin 2 of Burkitt’s Lymphoma Therapy with Anti-Pan B (Anti-CD19) Monoclonal Antibodies in a Mouse Xenotransplantation Model”, Cancer Res., 1989, 49, 3783.

6) E. Prosperi, “Intracellular Turnover of Fluorescein Diacetate. Influence of Membrane Ionic Gradients on Fluorescein Efflux”, Histochem.J., 1990, 22, 227.

常见问题Q&A

Q1:如何使用FDA。

 
 

 

 

 

A1:下面给出一个例子。请根据细胞的种类，观察条件讨论细胞的固定和试剂浓度。

【例1】HeLa细胞的形态观察

将1mg的FDA溶解在2ml的DMSO中(储存溶液)

用PBS(-)溶液稀释，设为2μmol/L。(用5ml PBS(-)稀释8μl贮存溶液)

1)用胰蛋白酶-EDTA等回收HaLa细胞，制备细胞悬浊液。

2)离心分离细胞悬浊液(1000rpm, 3min)

3)除去上清，添加PBS(-)(此时细胞数为105 ~ 106cells /mL)

4)通过粘贴等充分分散。

*因为培养液中的血清等有使背景上升的危险重复②~④的操作充分清洗。

5)在1.5 mL微管中添加用4)得到的30μL细胞悬浊液。

6)在此加入15μL的FDA溶液。

7)盖上微管，37℃下孵育15min。

8)在玻璃罩上放上7)的溶液10μL，从上面再盖上一层玻璃，夹入染色的细胞悬浊液。

9)将盖杯置于荧光显微镜下，用490nm滤光器激发，观察发出黄绿色荧光的活细胞。

例2:C57BL/6小鼠脾脏细胞的双重染色，使用FDA和PI。

k.h.j ones, j.a. senft, J.Histochem.Cytochem.， 33, 77 (1985).

将5mg的FDA溶解在1ml的丙酮中(储备溶液)

将上述0.04 mL溶液稀释为10ml PBS(-)。

PI将1mg溶解在50ml PBS(-)中。

在0.2 mL D-PBS溶液中混浊的细胞(2×106 cells/mL)溶液中添加0.1 mL的FDA溶液和0.03 mL的PI溶液。

孵化后观察。

【例3】使用HeLa细胞的细胞膜离子梯度对Fluorescein溶出的影响

·E.Prosperi, Histochem. J.， 22, 227 (1990).

将5mg的FDA溶解在1ml的丙酮中(储备溶液)

用PBS(-)，终浓度2.4μmol/L染色。
 

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。
A2：

excel11.png

CFSE试剂货号：C309 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate CFSE

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CFSE试剂货号：C309
5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate
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C29H19NO11

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2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride
PlasMem Bright Green细胞膜染色试剂
细胞膜染色试剂—绿色
Cellstain- CFSE试剂
5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-d

Cellstain- CFSE试剂货号：C375

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Cellstain- CFSE试剂货号：C375
5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate
CAS号：150347-59-4
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C29H19NO11

分子量：

557.46

特点：

 

● 可用于细胞增殖检测

● 长效荧光染色，最长三周可见

● 可用于流式细胞仪检测

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荧光特性
操作说明
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规格性状

规格

 

特性：该产物为无色至微黄色固体，可溶于二甲基亚砜和乙腈。

可溶于二甲基亚砜：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

荧光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE 是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFSE 在结构上将酚羟基部位改造成 AM 体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的 CFSE 的   AM 部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。CFSE 的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE 进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。另外，CFSE 标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。有报道证实 CFSE 毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

 

原理

C375_fig1(3).jpg

荧光特性

荧光波长：λex=496  nm, λem=516 nm

操作说明

＊建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、CFSE的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。

配制试剂：

1、从冰箱中取出CFSE试剂，放至室温后再打开。盛放CFSE的管子开盖前请轻弹管壁几次，让粉末充分落入管底，必要时可采用离心的方法。

2、取0.9 ml DMSOa)加到CFSE管中溶解，配制成2 mM的CFSE母液b)（加入DMSO后请先盖上盖子，反复颠倒把盖子和管壁上的试剂洗到底部，并用移液器反复吹打使溶解完全）。

3、用PBS(-)或适当的缓冲液将其稀释成100 μM或其它浓度（如果采用载玻片观察法，建议浓度为20 μM的工作液c))。

a)   DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

b)   由于CFSE母液遇水极易分解，所以建议分装保存，例如分装成5 μl/管。

方法：分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。

c)   CFSE工作液应现配现用，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。

* PBS(-)：不含钙和镁离子的PBS。

细胞染色(仅供参考)：

例1  培养板观察法

1、准备细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基a)调整细胞浓度至约107个／ml。

2、取1ml细胞悬液至试管中，加入适量CFSE工作液，轻轻搅拌混匀（建议CFSE的终浓度参考相关论文或做个预实验：分别设定终浓度为0.5,1,2,5,10,20 μM…,以确定最佳染色浓度b)）。

3、在37℃培养箱中培养15-30分钟。

4、离心后去上清，加入2 ml PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

5、加入合适的培养基制成细胞悬液。

6、取500 μl的细胞悬液加在培养孔中，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量c)进行实验。

例2 载玻片观察法

1、准备1 ml细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基a)调整细胞浓度至约107个／ml。

2、取30 μl细胞悬液至试管中，加入10 μl浓度为20 μM的CFSE工作液（终浓度为5μM），轻轻搅拌混匀b)。

3、在37 ℃培养箱中培养15-30分钟。

4、滴10 μl的细胞悬液在载玻片上，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量C)进行实验。

＊如果背景高的话，第3步之后需要洗去多余的CFSE：

离心后去上清，加入90 μl PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

a)尽可能用不含血清的培养基，血清中的酶和蛋白质会分解CFSE，可能会影响染色效果。

b)如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果细胞毒性大或背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

c)根据不同的实验目的和要求，采用稀释的方法调整细胞数量。

CFSE4.bmp

文献

1) M. Bronner-Fraser, “Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal  Antibody That Affects Cell Adhesion”, J. Cell  Biol., 1985, 101,  610.

2) A. Nose and M. Takeichi,  “A Novel Cadherin Cell Adhesion Molecule:Its Expression Patterns  Associated WithImplantation and Organogenesis of Mouse Embryos”, J. Cell Biol., 1986, 103, 2649.

3) S. A. Weston and C. R.  Parish, “New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis  by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”, J.  Immunol. Methods, 1990, 133,  87.

4) C. K. Raymond, P. J.  O’hara, G. Eichinger, J. H. Rothman and T. H. Stevens, “Molecular  Analysis of the Yeast VPS3 Gene and the Role of Its Product in Vacuolar  Protein Sorting and Vacuolar Segregation during the Cell Cycle”, J. Cell Biol., 1990, 111, 877.

5) G. Radcliff, R. Waite, J.  Lefevre, M. D. Poulik and D. M. Callewaert, “Quantification of  Effector/Target Conjugation Involving Natural Killer(NK) or Lymphokine  Activated Killer(LAK) Cells by Two-color Flow Cytometry”, J. Immunol. Methods, 1991, 139, 281.

6) S. A. Weston and C. R.  Parish, “Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph  Nodes”, Cytometry, 1992, 13, 739.

7) L. S. D. Clerck, C. H.  Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, “Use of  Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to  Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular  Function”, J. Immunol. Methods, 1994, 172, 115.

常见问题Q&A

 

 

Q1 请告诉我如何使用CFSE。

 
 

 

A1：参考文献[1]中的描述如下所示。

杀死7-10周大的CBA / H小鼠，去除脾脏（或其他目标器官），然后浸入F15培养基（1％FCS）中。

然后，通过金属网获得细胞悬液，并通过离心除去红细胞，死细胞等。

将纯化的淋巴细胞悬浮在pH 7.0的PBS中至50,000,000细胞/ mL。

加入5.0μM浓度的CFSE，并在37°C下标记15分钟。悬浮在冰冷却的F15培养基（1％FCS）中并离心

用（350g，5分钟，20℃）洗涤两次。悬浮在F15培养基中。

静脉注射到CBA / H小鼠中。一定时间后，杀死鼠标并去除脾脏（或其他目标器官）。

切除淋巴细胞并分离并通过流式细胞仪分析。

参考文献[2]是关于钙黄绿素-AM的，但也通过与[1]相同的步骤将其与CFSE进行了比较。

【参考文献】

1. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, J. Immunol. Methods, 133, 87 (1990).

2. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, Cytometry, 13, 739 (1992).
 

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。
A2：

excel11.png

 

 

Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留？
 

A3: “就细胞内保留而言，“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低，但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90％”

・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)

・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)”

但是，“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。

・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)

还要注意的一点是，原始的基本骨架是荧光素，因此由于激发光而褪色由于容易发生，因此可能难以通过长期激发来观察荧光。

（尽管最好使用防褪色剂等）

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒
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活细胞质染色-绿色——Calcein-AM
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活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号：C326
3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester
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分子式：

C46H46N2O23

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特点：

 

● 活细胞和死细胞可同时染色

● 490 nm激发波长，515 nm发射波长

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规格

 

特性：该产物为无色至微黄色固体，可溶于二甲基亚砜和乙腈。

可溶于二甲基亚砜：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，由于它在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂 (如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate) 相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。使用了Calcein的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。

Calcein-AM可与PI结合使用，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。

*Caution* 

Please tap the tube before opening, and open it with care. The content may have relocated from the bottom of the tube during the shipping.

*警告*

打开前请先轻敲试管，并小心打开。 在运输过程中，内装物可能已从试管底部移开。

C326-1.png

原理

Fig. 1  Cell staining mechanism

C326-2.jpg

产品特性

钙黄绿素-AM通过钙黄绿素的四个羧基的乙酰氧基甲基酯化（AM转化）而使其可透过细胞膜。钙黄绿素-AM本身几乎不显示荧光，但通过细胞内酯酶水解变成钙黄绿素。该钙黄绿素是不透膜的化合物，表现出强的黄绿色荧光（λex= 490 nm，λem= 515 nm）。羧基荧光素二乙酸盐（CFDA）和荧光素二乙酸盐（FDA）与荧光素-AM具有相同的荧光素骨架，被称为染色活细胞的染料。但是，这些化合物在显色后容易从细胞膜泄漏，这已成为使用中的问题之一。与这些染料相比，钙黄绿素-AM越来越多地用作显色后从细胞泄漏较少的染料。还已知它不抑制细胞功能，例如淋巴细胞增殖和白细胞趋化性。另外，钙黄绿素-AM在利用杀伤性T细胞和NK细胞的细胞毒性活性的测定中，与使用广泛使用的放射性同位素的51Cr释放方法得到相同的结果，因此细胞毒性较小。钙黄绿素-AM对活细胞染色，并用于在荧光显微镜和流式细胞仪下观察，但是当与死细胞染色染料组合使用时，常用于活细胞和死细胞的双重荧光染色。Papadopoulus等人使用Calcein-AM和Ethidium homodimer（EthD-1）进行双重染色，并使用两种染料的荧光波长差异通过流式细胞术研究细胞毒性。钙黄绿素-AM目前是用于染色活细胞的最有用的染料，因为它的细胞毒性较小，荧光后细胞泄漏较少。如上所述，目前正在使用放射性同位素的测量方法，但是从安全性和便利性的角度出发，期望使用荧光化合物的细胞研究的分析将继续进行。

荧光特性

λex=490 nm, λem=515 nm

操作说明

1. 用1ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l的Calcein-AM母液，-20℃下密闭冷冻保存。

2. 用PBS将Calcein-AM母液稀释制成1-50 µM的Calcein-AM溶液(现配现用)。

3. 吸掉预培养好的细胞中的培养基，用合适的缓冲液清洗2-3次。a)

4. 加入适量的Calcein-AM溶液，在37℃培养细胞15-30分钟。

5. 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。

6. 用490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a) 如果Calcein-AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂，如Pluronic® F127。

参考文献

1) K. McGinnes, G.Chapman, R.Marks and R.Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1986,86,7.

2) S.J.Morris,”Real-time Multi-wavelength Fluorescence Imaging of Living Cells”, BioTechniques,1990,8(3),296.

3) S.A.Weston and C.R.Parish,”New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”, J.Immunol.Methods,1990,133,87.

4) D.M.Callewaert,G.Radcliff,R.Waite,J.Lefevre and D.Poulik,”Characterization of Effector-Target Conjugates for Cloned Human Natural Killer and Human Lymphokine Activated Killer Cells by Flow Cytometry”,Cytometry,1991,12,666.

5) Han-Qing Xie, R.Huang and V.W.Hu, “Intercellular Communication Through Gap Junctions Is Reduced in Senescent Cell”, Biophys.J,1992,62,45.

6) S.A.Weston and C.R.Parish,”Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13,739.

7) X.M.Wang, P.I.Terasaki,G.W. Rankin Jr. ,D.Chia,H.P.Zhong and S.Hardy,”A New Microcellular Cytotoxicity Test Based on Calcein AM Release”, Hum. Immunol.,1993,37,264.

8) N.G.Papadopoulos,G.V.Dedoussis,G.Spanakos,A.D.Gritzapis, C.N.Baxevanis and M.Papamichail,”An Improved Fluorescence Assay for the Determination of Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1994,177,101.

9) L.S.De Clerck,C.H.Bridts,A.M.Mertens,M.M.Moens and W.J.Stevens,”Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”, J.Immunol. Methods,1994,172,115.

10) H.Ohata,Y.Ujiki and K.Momose,”Confocal Imaging Analysis of ATP-Induced Ca2+ Response in Individual Endothelial Cells of the Artery in Situ”, Am.J.Physiol. ,1997,272(6),1980.

常见问题Q&A

Q1：与51Cr释放方法有关吗
 

A1: “钙黄绿素-AM与51Cr释放方法之间存在相关性。

以下文件中有一份报告。N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)”
 

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。
A2：

excel11.png

 

Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留？
 

A3: “就细胞内保留而言，“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低，但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90％”

・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)

・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)”

但是，“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。

・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)

还要注意的一点是，原始的基本骨架是荧光素，因此由于激发光而褪色由于容易发生，因此可能难以通过长期激发来观察荧光。

（尽管最好使用防褪色剂等）
Q4：如何使用Calcein-AM。
 

A4：下面以HeLa细胞的情况为例进行介绍。

根据细胞类型和观察条件考虑并固定试剂浓度。

【试剂】

溶液A：将1 mg钙黄绿素-AM溶于1 ml DMSO→1 mmol / L溶液

*将溶液存放在-20°C的阴凉处，以防止变质。

溶液B：用PBS（-）将溶液A稀释500倍（用5 mL PBS稀释10μl溶液A得到2μmol/ L）。

* Calcein-AM在水溶液中分解，因此在使用前请准备溶液B。

【操作】

1）用胰蛋白酶-EDTA收集HeLa细胞并制备细胞悬液。

2）离心细胞悬液（1,000 rpm，3分钟）

3）除去上清液并添加PBS（-）（此时，准备细胞数为105至106细胞/ mL）。

4）用移液器充分分散。

*由于培养液中的血清可能会升高背景，请执行操作2）至4）。

重复并彻底清洗。

5）将30μl在4）中获得的细胞悬液添加至1.5ml微管中。

6）向其中加入15μL[液体B]。

7）盖上微管并在37°C下孵育15分钟。

8）将10μL7）的溶液放在盖玻片上，从上方堆叠盖玻片，然后将染色的细胞悬液夹在中间。

9）将盖玻片放在荧光显微镜下，用490 nm的滤光片激发，观察发出黄绿色荧光的活细胞。

（对于滤光片，如果是490±10 nm，则可以观察到）

*排除血清和酚红，因为它们是背景。

*如果背景很高，请清洁它。

*在载玻片上培养的细胞可以用相同的方式染色和观察。

*有关使用PI的双重染色方法，请参阅方案“我要分别对活细胞和死细胞进行染色”。
 

Q5：我已经购买了钙黄绿素-AM（粉末），并希望将其制成溶液。 我该怎么办？
 

A5:溶于DMSO。

分子量几乎为1000，因此，如果将1 mg溶于1 mL DMSO，它将是1 mM的溶液。

请使用尽可能干燥的DMSO。

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542 活死细胞双染试剂盒

发表于由
Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号：C542
活死细胞双染试剂盒
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：室温
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选择规格：
500 tests
3000 tests
现货
细胞染色
产品解说
活动进行中
试剂盒内含
产品概述
荧光特性
染色例
最佳浓度摸索
操作步骤
注意事项
参考文献

产品解说

 

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试剂盒内含

                                                                     500 次            3000 次

・Calcein-AM Reagent                             200 μg x 1        1 mg x 1

・PI Stock Solution (1.5 mmol/l)              200 μl x 1         1 ml x 1

・DMSO                                                    200 μl x 1         1 ml x 1

产品概述

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒内含两种染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团，产生的Calcein (钙黄绿素) 发出强绿色荧光，因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，因此死细胞会被检测到红色荧光。除了用荧光显微镜外，也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。

荧光特性

Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm

PI : λex=530 nm , λem=580 nm

染色例

                                                                           细胞染色实例

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（a）                                     （b）                                      （c）

a)  Calcein-AM染FTC细胞（活细胞单染）

b)  PI染HCT116细胞（死细胞单染）

c)  Calcein-AM、PI染MHD-1 细胞（活死细胞双染）

最佳浓度摸索

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。

Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度：

1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。

2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

操作步骤

以HeLa细胞为例

制备1 mmol/l的Calcein-AM储存液

【500 次】

将200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

【3000 次】

将1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。

※Calcein-AM储存液需要避光，在-20℃密封保存。

 

制备染色工作液

将Calcein-AM储存液和PI储存液恢复至室温后使用。

在5 ml的PBS（-）中加入10 μl Calcein-AM储存液和15 μl PI储存液，混匀制成工作液。此时Calcein-AM的浓度为2 μmol/l，而PI的浓度为4.5 μmol/l。

 

染色步骤

1、 用Trypsin-EDTA消化细胞。

2、 通过离心收集细胞（1,000 rpm，3 min）。

3、 去除上清液，加入PBS（-）制备细胞悬液（105 – 106 cells/ml为宜）。

4、 重复步骤2和步骤3数次以消除培养基中的酯酶活性。

5、 取100 μl 染色工作液与200 μl 细胞悬液混合，在37℃培养15 min。

6、 在490±10 nm激发波长下同时观察黄绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞。另外用545 nm激发波长单独观察死细胞。

注意事项

1、 由于本试剂盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先涡旋以使其振落下来。

2、 由于Calcein-AM储存液对潮气敏感，请在使用后密闭Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成10 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

3、 配制好的染色工作液请在当天使用。

4、 PI有疑似致癌性，使用前应注意以下几点：

1） 使用时请带好手套，口罩，防护眼镜等，不要接触到或呼吸到。

2） 当PI不慎接触到皮肤时，请立刻用大量的水冲洗。

3） 处理方法

清洗容器的清洗液和废液请按照实验室的有毒有害物质的处理方法进行处理，或按照以下方法处理：

・用UV照射的方法进行分解

・用次氯酸钠氧化分解后，进行中和处理

参考文献

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Materials Today, 2020, doi.org/10.1016/j.mattod.2019.12.005

2. Mitochondria-Targeted Artificial “Nano-RBCs” for Amplified Synergistic Cancer Phototherapy by a Single NIR Irradiation,

Advanced Science, 2018, 5, 1800049

3. 4D-Printed Biodegradable and Remotely Controllable Shape Memory Occlusion Devices,

Advanced Functional Materials, 2019, 29(51), 1906569

4. Magnetic Hyperthermia-Synergistic H2O2 Self-Sufficient Catalytic Suppression of Osteosarcoma with Enhanced Bone-Re

generation Bioactivity by 3D-Printing Composite, Advanced Functional Materials, 2019, 1907071

5. A Substitution-Dependent Light-Up Fluorescence Probe for Selectively Detecting Fe3+ Ions and Its Cell Imaging Application,

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6. An Extendable Star-Like Nanoplatform for Functional and Anatomical Imaging-Guided Photothermal Oncotherapy,

ACS Nano, 2019, 13(4), 4379-4391

7. Near-Infrared Light-Triggered Sulfur Dioxide Gas Therapy of Cancer, ACS Nano, 2019, 13(2), 2103-2113

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ACS Nano, 2018, 12(4), 3780-3795

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15. Magnetic-responsive and targeted cancer nanotheranostics by PA/MR bimodal imaging-guided photothermally triggered

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25. Synthesis and characterization of hierarchically macroporous and mesoporous CaO-MO-SiO2-P2O5(M=Mg,Zn,Sr) bioactive

glass scaffolds, Acta Biomaterialia, 2011, 7(10), 3638-3644

死细胞标记试剂– Deep Red货号：C556 死细胞标记试剂– Deep Red

发表于由
死细胞标记试剂– Deep Red货号：C556
死细胞标记试剂– Deep Red
Dead Cell Makeup Deep Red – Higher Retention than PI
商品信息
储存条件：-20°C，避光
运输条件：常温运输

特点：

 

● 流式细胞仪检测

● 可固定细胞

● 荧光不会泄露

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选择规格：
100tests
现货
产品概述
技术信息
DMSO 储存溶液的保质期
与现有 PI 方法的比较
实验案例： 诱导 MOLT-4 细胞衰竭后的 PD-1 检测
常见问题Q&A

产品概述

该试剂可与细胞表面和细胞内的蛋白质共价结合，对膜受损的死亡细胞进行强染色。此外，染色剂在固定和渗透细胞后不会渗漏。染色后，活细胞和死细胞的荧光强度差异显著，通过流式细胞仪分析，死细胞很容易区分和排除。

技术信息

 

区分和排除死细胞对使用流式细胞仪 (FCM) 获得准确数据至关重要，近年来，这一过程已成为发表论文时越来越常见的要求。碘化丙啶（PI）可用于区分死细胞，但细胞膜的固定或渗透会导致 PI 从细胞中渗出，从而难以获得准确的数据。这种试剂具有与细胞表面和细胞内部蛋白质共价结合的特性，因此即使细胞被固定或渗透后，染料也不会渗出。此外，染色后活细胞和死细胞的荧光强度差异很大，因此 FCM 可以轻松区分死细胞并将其排除在分析之外。

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DMSO 储存溶液的保质期

本产品的 DMSO 储备溶液可冷冻保存六个月。

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与现有 PI 方法的比较

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实验案例： 诱导 MOLT-4 细胞衰竭后的 PD-1 检测

MOLT-4 细胞在含有 Ionomycin（500 ng/ml）和 PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate，50 ng/ml）的 RPMI 培养基中刺激 48 小时。死细胞用本品染色，PD-1 表达用免疫染色法检测（一抗：抗 PD-1 小鼠抗体，二抗：抗小鼠抗体-Alexa488）。结果表明，死细胞和活细胞可以清楚地区分开来，而且在只选取活细胞的情况下，受刺激细胞组的 PD-1 表达升高。

实验步骤

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试验结果

常见问题Q&A

Q1：能否测量贴壁细胞？
A1：可对贴壁细胞进行检测。用胰蛋白酶消化细胞或用刮板收集细胞，以制备细胞悬液。
Q2：胰蛋白酶会干扰测量吗？
A2：通过以下实验证实胰蛋白酶对 HeLa 细胞的影响。我们将胰蛋白酶处理与使用刮板进行了比较，确认两种情况下的分析结果没有区别。

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Q3：是否可以用显微镜进行观察？
A3：我们已经证实，可以对染色后的 HeLa 细胞进行成像。用这种染料染色的 HeLa 细胞在固定和膜渗透后的成像结果如下。

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Q4：染色是否会产生细胞毒性？
A4：使用CCK-8 来评估染色对 HeLa 细胞的细胞毒性，结果显示几乎没有细胞毒性。
Q5：染色后能否保存固定的细胞？
A5：不建议保存。由于荧光强度在固定后会随着时间的推移而降低，因此染色后的样本应在当天进行检测。
Q6：DMSO stock solution的稳定性如何？
A6：该产品在 -20°C 下冷冻保存 6 个月是稳定的。本品受潮后会降解；如果考虑长期储存超过 6 个月，请使用未开封且含水量低的DMSO。

此外，如有必要，可将产品分成小份储存
Q7：如何对细胞进行栅极化？
A7：以下是使用 Becton Dickinson (BD) 流式细胞仪的方法。

 

 

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死细胞标记试剂–Blue货号：C555 死细胞标记试剂–Blue

发表于由
死细胞标记试剂–Blue货号：C555
死细胞标记试剂–Blue
Dead Cell Makeup Blue – Higher Retention than PI
商品信息
储存条件：0-5°C，避光
运输条件：常温运输

特点：

 

● 染料不会从死细胞中泄漏

● 储备溶液可以冷冻保存6个月

● 有两种不同的颜色可供选择

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C555/C556宣传资料
选择规格：
100tests
现货
产品概述
技术信息
DMSO 储存溶液的保质期
与现有 PI 方法的比较
实验案例： 诱导 MOLT-4 细胞衰竭后的 PD-1 检测
常见问题Q&A

产品概述

该试剂可与细胞表面和细胞内的蛋白质共价结合，对膜受损的死亡细胞进行强染色。此外，染色剂在固定和渗透细胞后不会渗漏。染色后，活细胞和死细胞的荧光强度差异显著，通过流式细胞仪分析，死细胞很容易区分和排除。

技术信息

区分和排除死细胞对使用流式细胞仪 (FCM) 获得准确数据至关重要，近年来，这一过程已成为发表论文时越来越常见的要求。碘化丙啶（PI）可用于区分死细胞，但细胞膜的固定或渗透会导致 PI 从细胞中渗出，从而难以获得准确的数据。这种试剂具有与细胞表面和细胞内部蛋白质共价结合的特性，因此即使细胞被固定或渗透后，染料也不会渗出。此外，染色后活细胞和死细胞的荧光强度差异很大，因此 FCM 可以轻松区分死细胞并将其排除在分析之外。

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DMSO 储存溶液的保质期

本产品的 DMSO 储备溶液可冷冻保存六个月。

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与现有 PI 方法的比较

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实验案例： 诱导 MOLT-4 细胞衰竭后的 PD-1 检测

MOLT-4 细胞在含有 Ionomycin（500 ng/ml）和 PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate，50 ng/ml）的 RPMI 培养基中刺激 48 小时。死细胞用本品染色，PD-1 表达用免疫染色法检测（一抗：抗 PD-1 小鼠抗体，二抗：抗小鼠抗体-Alexa488）。结果表明，死细胞和活细胞可以清楚地区分开来，而且在只选取活细胞的情况下，受刺激细胞组的 PD-1 表达升高。

实验步骤

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试验结果

常见问题Q&A

Q1：能否测量贴壁细胞？
A1：可对贴壁细胞进行检测。用胰蛋白酶消化细胞或用刮板收集细胞，以制备细胞悬液。
Q2：胰蛋白酶会干扰测量吗？
A2：通过以下实验证实胰蛋白酶对 HeLa 细胞的影响。我们将胰蛋白酶处理与使用刮板进行了比较，确认两种情况下的分析结果没有区别。

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Q3：是否可以用显微镜进行观察？
A3：我们已经证实，可以对染色后的 HeLa 细胞进行成像。用这种染料染色的 HeLa 细胞在固定和膜渗透后的成像结果如下。

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Q4：染色是否会产生细胞毒性？
A4：使用CCK-8 来评估染色对 HeLa 细胞的细胞毒性，结果显示几乎没有细胞毒性。
Q5：染色后能否保存固定的细胞？
A5：不建议保存。由于荧光强度在固定后会随着时间的推移而降低，因此染色后的样本应在当天进行检测。
Q6：DMSO stock solution的稳定性如何？
A6：该产品在 -20°C 下冷冻保存 6 个月是稳定的。本品受潮后会降解；如果考虑长期储存超过 6 个月，请使用未开封且含水量低的DMSO。

此外，如有必要，可将产品分成小份储存
Q7：如何对细胞进行栅极化？
A7：以下是使用 Becton Dickinson (BD) 流式细胞仪的方法。

 

 

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