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NO.1.    Cellular Senescence Detection Kit    细胞衰老检测

NO.2.    Cell Cycle Assay Kit    细胞周期检测

NO.3.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.4.    BCECF-AM    细胞内pH值检测 

NO.5.    Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-    细胞凋亡检测

该产品是一种试剂盒，可通过细胞培养板轻松检测SA-β-gal（细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶）活性，SA-β-gal是衰老细胞的指标。 SPiDER-βGal是一种β-半乳糖苷酶检测试剂，只需将试剂添加到96孔板中，即可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估。
根据细胞数的SA-β-gal活性可以通过计算该细胞数，测量核酸（相关产物）的量或蛋白质的量来校正。并通过该试剂盒获得的测量值来评估衰老程度。

轻松量化衰老细胞

预先准备的细胞在该试剂盒随附的缓冲液中裂解。只需将荧光底物SPiDER-βGal加到细胞裂解液中，即可根据SA-β-gal活性检测荧光强度。
即使在10 cm培养皿或其它容器中制备细胞，也可以通过在细胞裂解后将细胞裂解液转移到96孔板上来检测荧光强度。

与荧光成像结果的相关性：

用平板分析法和细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对不同传代水平的WI-38细胞进行荧光成像实验结果。

结果证实了在2种试剂盒中，SA-β-gal染色在高传代的WI-38细胞中荧光强度有明显增强。

请注意尽管初始细胞接种密度是相同的，但由于较高传代水平下衰老细胞的增殖率较低，因此平板分析时的细胞密度会有所不同。在本实验中我们用检测细胞核的细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）获得的结果来校正SA-β-gal活性。
平板测定<检测条件>
EX:535 nm/Em:580nm
荧光数据<检测条件>
绿色：EX:488 nm/Em:500-600nm
（用细胞衰老检测试剂盒(货号SG03)对SA-β-Gal进行染色
蓝色：EX:405 nm/Em:450-495 nm
（用DAPI溶液进行核染色（货号：D523））

加药实验：

加入阿霉素后，我们使用该试剂盒对WI-38细胞进行了分析，阿霉素会增加线粒体活性氧（ROS）的产生。结果证实由于DNA损伤诱导的衰老，向WI-38细胞中添加阿霉素会引起SA-β-gal的染色强度增加。

＜检测条件＞

Ex:535 nm/Em:580 nm

用微孔板分析细胞时，会由于孔中细胞的数量不同导致结果可能不同。在此情况下，有必要通过对细胞进行计数并检查蛋白质总量来校正（标准化）获得的测量值。使用细胞计数标准化试剂盒，只需将试剂加到细胞培养基中，即可通过对细胞核染色获得的荧光强度轻松检测细胞数量。

有关细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）的产品信息请点击这里

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NO.1.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测   

NO.2.    Glucose Assay Kit-WST    葡萄糖检测

NO.3.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.4.    Lactate Assay Kit-WST    乳酸检测

NO.5.    Lipi-Green    脂滴检测（绿色）

源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）被广泛用作报告基因分析标记。X-gal染色被广泛用作检测β-半乳糖苷酶的典型方法，但是由于细胞膜通透性差，必须固定细胞和组织。另外由于常规的β-半乳糖苷酶检测荧光剂仅具有较低的细胞内滞留性，所以存在不能清楚地区分不表达β-半乳糖苷酶的细胞和表达β-半乳糖苷酶的细胞的问题。
为了克服这些问题，浦野、神谷等研究者成功开发出了具有细胞膜穿透性和细胞内滞留性的新荧光试剂SPiDER-βGal 。该试剂通过与β-半乳糖苷酶的酶促反应形成中间体醌甲基化物，并与蛋白质中的SH基等亲核基团形成稳定的共价键，并发出荧光。以此方式，将反应的试剂固定在细胞内蛋白上并具有优异的细胞内滞留性，结果证明可以在单个细胞水平上清楚地检测到表达β-半乳糖苷酶的细胞。

SPiDER-βGal的细胞染色原理

SPiDER-βGal透过细胞膜后，在β-半乳糖苷酶的酶促反应下迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，可以和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光，并可以自我固定在细胞内的蛋白质上而滞留在细胞内。

          加入试剂                                 培养15分钟                                 观察

用缓冲液清洗细胞后，              在避光条件下培养15分钟，           用荧光显微镜或流式细胞仪

加入SPiDER-βGal染色液。               用缓冲液清洗细胞。                                观察。

组织的荧光成像

果蝇组织的实时成像
（数据由东京大学大学院医学系研究科浦野泰幸教授提供）

活细胞和固定细胞的荧光成像

SPiDER-βGal对HEK/LacZ细胞和细胞数比为1:1的HEK细胞的染色图
A.活细胞，B.固定细胞（4％PFA/PBS）
（绿色：SPiDER-βGal，蓝色：Hoechst 33342）

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合培养，分别在固定前和固定后用SPiDER-βGal染色，用共聚焦显微镜观察。证实了由于SPiDER-βGal具有很好的膜通透性和能在细胞内长时间滞留，可以在固定前和固定后进行荧光成像。

用流式细胞仪检测表达β-半乳糖苷酶的细胞

使用SPiDER-βGal通过流式细胞仪对HEK/LacZ细胞和HEK细胞分别进行检测。

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合并培养，并在用SPiDER-βGal染色后用流式细胞仪进行检测。通过在细胞中滞留的SPiDER-βGal，可以区分β-半乳糖苷酶稳定表达菌株（绿色）和非表达菌株（灰色）。

组织样品中的SA-β-gal检测

有研究人员发表了一篇论文，其中使用糖尿病模型小鼠的组织样本通过SPiDER-βGal检测到了SA-β-gal。

<组织样本的染色条件>
将快速冷冻的组织切片后，将其浸入4％多聚甲醛中，并在室温下培养20分钟。然后将20 μmol/l SPiDER-βGal加到用PBS洗涤过的样品中，并在37℃培养1小时。 最后将样品用PBS洗涤并观察。

有关实验操作和数据的详细信息，请参阅以下参考文献中的5）。

SPiDER-βGal与β-半乳糖苷酶反应后的激发/发射光谱

<推荐滤波片>
激发：500-540 nm
荧光：530-570 nm
使用共聚焦激光显微镜和流式细胞仪
我们有使用488 nm激发进行检测的记录。

1) Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution,Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,2016,doi:10.1002/anie.201603328

2) Changes in expression of C2cd4c in pancreatic endocrine cells during pancreatic development,FEBS Lett.,2016,doi:10.1002/1873-3468.12271

3) A topically-sprayable, activatable fluorescent and retaining probe, SPiDER-βGal for detecting cancer; Advantages of anchoring to cellular proteins after activation ,Oncotarget,2017,doi:10.18632/oncotarget.17080.

4) Developmental vascular remodeling defects and postnatal kidney failure in mice lacking Gpr116 (Adgrf5) and Eltd1 (Adgrl4),PLoS ONE.,2017,10.1371/journal.pone.0183166.

5) Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality,NPJ. Aging Mech. Dis.,2017, DOI:10.1038/s41514-017-0012-0.

6) Ecrg4 deficiency results in extended replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner,Development,2019,doi:10.1242/dev.168120 .

7) Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs,Exp. Gerontol.,2019,119,157.

8) β-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4,Molecular Cell,2019,71,1064-1078.

9) Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype,Nature Commun.,2020,11,481.

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NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

NO.2.    Mitophagy Detection Kit    线粒体自噬

NO.3.    Cell Cycle Assay Kit    细胞周期检测

NO.4.    Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric    细胞凋亡检测  

NO.5.    Cellstain- Hoechst 33342 solution    细胞核染色检测

正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：

1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。

2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。

3)染色时间长。

本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。

由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。

SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图

<推荐波长>

Ex：500~540 nm

Em：530~570 nm

用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）

特点1：适用于活细胞和固定细胞

检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。

*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。

特点2：可定量检测

细胞衰老与细胞周期之间的关系

阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。

与其他细胞衰老标记物的共染色

本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例^a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色^b），以及全细胞的核染色（DAPI）^c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。^d）

1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。

2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。

3）PBS清洗细胞3次。

4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。

5）PBS清洗细胞3次。

6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。

7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。

8）PBS清洗细胞3次。

9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。

10）PBS清洗细胞3次。

11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液 同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。

12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。

固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染

SPiDER-βGal工作液配制

用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。

*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。

McIlvaine buffer（pH6.0）的制备

将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。

染色步骤（35 mm 培养皿）

1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。

*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低

3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。

4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。

＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。

5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。

6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。

7.用PBS洗涤细胞2次。

8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。

9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。

10.用PBS洗涤细胞3次。

11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。

12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。

SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）

爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。

这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。

染色条件：

① SPiDER-βGal 方法

② X-gal 方法

*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供

用共聚焦成像细胞仪进行定量用

用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。

■与其他细胞衰老标记物共染色用

SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。

定量解析

散点图（Scatter Plot）

使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。

活细胞荧光染色的分析

X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。

而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。

横河电机

CQ01 拍摄条件

使用孔板：96 孔板

物镜：10 倍

拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan

488 nm （SPiDER-βGal Green）

视野：8视野

*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）

WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。

SA-β-gal的荧光成像

1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。

4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.

6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。

用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞

1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×10⁵ 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO₂培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养1 h。

4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO₂培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。

6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。

7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。