特点：
● 享有显色底物WST专利
● 用于L-Glutamate的定量
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试剂盒内含
产品概述
谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。
Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。
原理
本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。
操作步骤
只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。
实验例
标准曲线的实验例：
样品中的谷氨酸浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酸标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酸浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。
谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：
将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。
结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。
铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:
据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。
Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：
将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。
结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。
<使用产品>
· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）
· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）
· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）
· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）
<实验条件>
细胞：A549细胞 (1 x 106 cells) 药物处理时间：48 h
参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.
常见问题Q&A
| Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量是多少？ |
| A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。
100 tests 样品数量(n=3) 24个样品(参照下图) 谷氨酸标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)
|
| Q2：配制后的Working solution可以保存多久？ |
| A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。
※Working solution配制后，避光室温条件下4 h稳定。当暴露于光线下，溶液的颜色会变成褐色。 |
| Q3：是否可以定量D-Glutamate？ |
| A3：该试剂盒是用于L-Glutamate定量，无法定量D-Glutamate。 |
| Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？ |
| A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酸浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。 |
| Q5：待测样品可以保存吗？ |
| A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。
细胞裂解样品也可以-20°C保存1个月。 但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。 |
| Q6：为什么我的样品孔没有显色？ |
| A6：样品中的谷氨酸浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酸浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。
如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酸浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酸浓度调整到最低检测限以上。 |
| Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？ |
| A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)
|
参考文献
1)Cobler,L.et al.,”xCT inhibition sensitizes tumors to γ-radiation via glutathione reduction”,Oncotarget,2018,9,32280-32297.
2)Tobias,M.et al.,”Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication”,Free Radical Bioglogy and Medicine,2019,133,144-152.
3)K. Danchana, H. Iwasaki, K. Ochiai, H. Namba, T. Kaneta, “Determination of glutamate using paper-based microfluidic devices with colorimetric detection for food samples”, Microchem. J., 2022, doi:10.1016/j.microc.2022.107513.
4)Z. Xie, T. Kawasaki, H. Zhou, D. Okuzaki, N. Okada and M. Tachbana, “Targeting GGT1 Eliminates the Tumor-Promoting Effect and Enhanced Immunosuppressive Function of Myeloid-Derived Suppressor Cells Caused by G-CSF”, Front. Pharmacol., 2022, doi:10.3389/fphar.2022.873792.
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